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申请/专利权人：中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院

摘要：本发明涉及一种用于肝癌早期诊断的检测AFP‑L3的ELISA试剂盒及检测方法，该试剂盒包括AFP‑L3标准品、AFP单克隆抗体包被的酶标板、生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶SA‑HRP、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液、终止液。采用该试剂盒进行检测的方法为：在AFP单克隆抗体包被的酶标板中加待测样品，然后加生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素，随后加链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶；再加入显色液，最后加入终止液终止反应，并采用酶联检测仪测定吸光度值。本发明的试剂盒直接通过凝集素代替二抗对AFP‑L3进行检测，使AFP‑L3的检测更加简便、快捷。

主权项：1.一种用于肝癌早期诊断的定量检测AFP-L3的ELISA试剂盒，其特征在于：所述的ELISA试剂盒包括：（A）AFP-L3标准品；（B）AFP单克隆抗体包被的酶标板；（C）生物素标记的橙黄网孢盘菌凝集素、链霉亲合素标记的辣根过氧化物酶、稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液；所述AFP-L3标准品的制备方法为：称取1000µgAFP标准品，溶于1mL的浓度为0.01molL且pH为7.4的PBS缓冲液，吸取600µL加入到小扁豆凝集素亲和吸附离心管中，室温静置10min，吸取1.2mL清洗液加入离心管中，3000r室温下离心20s，弃去离心液体，加入600µL洗脱液到上部离心管，3000r室温下离心收集离心柱外管液体，即所需要的AFP-L3标准品；所述AFP单克隆抗体包被的酶标板的制备过程为：取1mgmL的AFP单克隆抗体用包被液以1:800的比例稀释后加入酶标板各孔，每孔100µL，4℃包被过夜；随后甩去酶标板孔内液体，采用洗涤液PBST浸泡3min，反复洗涤3次，拍干酶标板内液体后用封闭液，200µL孔，室温孵育30min，再次洗板3次，甩干后拍干，每孔加入100µLPH为4.5，浓度为20mmolL的醋酸钠，4℃孵育30min后甩干，随后加入新鲜配置的25mmolLNaIO4溶于PH为4.5的醋酸钠中，每孔100μL，4℃避光孵育1.5h后20mmolL醋酸钠洗涤3次，每次5min，拍干后加入1mmolLMPBH每孔100μL，18-22℃，避光孵育2h后加入1mmolLCys-Gly溶液每孔100μL，4℃避光孵育过夜；最后采用洗涤液PBST洗3次板，每次5分钟，甩干后晾干，即获得AFP-L3单克隆抗体包被的酶标板；所述稀释液为PBS缓冲液；所述PBS缓冲液的配制方法为：将0.2700ɡKH2PO4、1.4200ɡNa2HPO4、8.0000ɡNaCl、0.2000ɡKCl、加去离子水约800mL，充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调节PH至7.4，并定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；所述洗涤液为PBST缓冲液；所述PBST缓冲液的配制方法为：将8.0gNaCl、0.2gKCl、0.26gKH2PO4、2.9gNa2HPO4•12H2O、0.5mLTween-20、0.2gNaN3，加蒸馏水溶解后定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；所述封闭液为含1%BSA的PBST缓冲液，配置好的封闭液经过滤除菌后，4℃保存；所述TMB显色液为磷酸盐-枸橼酸缓冲液；所述终止液为将90mL蒸馏水，逐渐滴加入10mL98%浓硫酸中所配制而成的溶液。

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百度查询： 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院 用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体AFP-L3的ELISA试剂盒及检测方法