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申请/专利权人：中国科学院海洋研究所

摘要：本发明属于透射电子显微镜技术领域，具体涉及一种鼠血管内皮糖萼的体外制样方法。本发明能够达到体外观测糖萼预测疾病发展情况的要求。结果表明，丙酮脱水的体外电镜制样方法能够保存小鼠大血管糖萼的完整性，而冷冻替代脱水的制样方法在保存小鼠大血管糖萼完整性的同时还能保留小鼠糖萼针状超微结构。对于小鼠微血管，丙酮脱水的体外电镜制样方法能够有效保存小鼠微血管糖萼的完整性，并且优于乙醇梯度脱水和冷冻替代脱水的糖萼体外电镜制样方法。本发明为研究以小鼠为模型的、与糖萼相关的科学研究及疾病诊断提供了相关方法。此外，我们的研究为制备糖萼样品提供了一种可选的、实用的、方便快捷的方法，大大节省了成本和资源，使实验更具普适性。

主权项：1.一种鼠血管内皮糖萼的体外制样方法，其特征包括如下步骤：1）、小鼠腹腔麻醉，右心室放血，左心室以1~2mLmin的流速灌注质量浓度1.5~2.0%硝酸镧灌注液，灌注5~10min；再用质量浓度1.5~2.0%硝酸镧固定液以1~2mLmin的流速灌注，灌注10~15min，取小鼠主动脉和或肾脏皮髓交界处组织，大小为0.8~1mm3，放入硝酸镧固定液1.5~2.0mL中，固定2~3h，硝酸镧灌注液为硝酸镧1.5~2.0g+二甲胂酸钠1.0~1.1g，用0.2~0.3molL的盐酸调PH值为7.1~7.4，用双蒸水定容至100mL；硝酸镧固定液为硝酸镧1.5~2.0g+多聚甲醛1.5~2.0g+二甲胂酸钠1.0~1.1g+质量浓度49~50%戊二醛溶液4.5~5.0mL，用0.2~0.3molL的盐酸调PH值为7.1~7.4，用双蒸水定容至100mL；2）、用质量浓度1.5~2.0%硝酸镧作为漂洗液对步骤1）得到的样品浸泡漂洗3~4次，每次硝酸镧漂洗液用量为1.5~2.0mL，每次浸泡时间10~15min；再将样品放入0.5~1.0mL质量浓度1~2%锇酸溶液中，固定1~2h；然后，用质量浓度1.5~2.0%硝酸镧漂洗液浸泡漂洗锇酸固定完成的样品3~4次，每次硝酸镧漂洗液用量为1.5~2.0mL，每次浸泡时间10~15min；3）、对上述步骤2）固定、清洗后的样品进行丙酮梯度脱水和冷冻替代脱水；丙酮梯度脱水：采用体积浓度29~30%、49~50%、69~70%、79~80%，89~90%，99~100%丙酮溶液依次对步骤2）得到的样品脱水，每个丙酮溶液的用量分别为1.5~2.0mL，每个丙酮溶液的脱水时间为15~20min；冷冻替代脱水，该步骤在冷冻替代仪中进行：在-1~0℃下，用1.5~2.0mL体积浓度29~30%的丙酮处理步骤2）得到的样本10~15min；之后从-1~0℃降至-19~-20℃，并用1.5~2.0mL体积浓度49~50%的丙酮处理25~30min；然后，在-19~-20℃条件下，分别用体积浓度69~70%、84~85%、94~95%、99~100%的丙酮依次对样本脱水，每个丙酮溶液的用量分别为1.5~2.0mL，每个丙酮溶液的脱水时间为25~30min；4）、对步骤3）得到的样品进行树脂包埋和固化；5）、对步骤4）得到的样品在超薄切片机上进行半薄切片，半薄切片厚度0.8~1μm，定位至主动脉肾小球区域，定位之后对样品进行超薄切片，切片厚度50~70nm；6）、将步骤5）所得的切片用醋酸铀-柠檬酸铅双染色。

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