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申请/专利权人：中国科学院西北高原生物研究所

摘要：本发明公开了黄绿卷毛菇中具有抗肝损伤活性新二肽FlolutsinA的分离工艺及其应用。具体方法：提取、QuikSepPS中压色谱粗分、抗肝损伤活性组分初筛、MegressC18反相制备柱制备、抗肝损伤活性组分再筛、ACEExcelC18AR反相制备柱制备、抗肝损伤体外活性评价七个步骤。工艺中使用的溶剂和分离材料可回收重复利用，保证了较低廉的分离制备成本，高压制备色谱分离可保证产品的纯度大于95％；活性筛选方法简单，质量稳定可控；实验操作简单，成本低廉，质量可控，结果直观，易判断；所得的抗肝损伤活性化合物可用于制备抗非酒精性脂肪肝病药物；本发明的制备工艺可实现规模化生产。

主权项：1.黄绿卷毛菇中具有抗肝损伤活性新二肽FlolutsinA的分离工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：步骤1，提取：将黄绿卷毛菇鲜样粗碎后，按照1g：5mL～100mL的固液比用95％的乙醇室温提取，提取2～4次，每次12～24小时，过滤、合并滤液，即滤液A，将滤液A减压干燥至膏状，即得黄绿卷毛菇乙醇提取物浸膏；所述黄绿卷毛菇乙醇提取物浸膏利用体积比为1:1的石油醚和水萃取，浓缩水相部位，按硅胶的量：水相部位的量＝3:1拌样并减压干燥，即得黄绿卷毛菇水相拌样样品；步骤2，QuikSepPS中压色谱粗分：黄绿卷毛菇水相拌样样品，该样品经装有QuikSepPS的中压色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，根据色谱峰形收集6个主要的馏分，然后将各个馏分减压干燥即得到Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6共6个组分样品；步骤3，抗肝损伤活性组分初筛：将上述6个组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mgmL的样品溶液；将人肝癌细胞HepG2按照2.5×105的密度接种于6孔板，待其贴壁生长至对数生长期后，将各个组分与工作浓度为600μM的油酸加至6孔板中，共孵育24小时；24小时后，弃去培养基，4％甲醛固定细胞15分钟，用蒸馏水洗掉残留4％甲醛后，异丙醇漂洗细胞20秒，油红O染色40分钟；40分钟后蒸馏水洗掉残留油红O染液；异丙醇浸泡细胞40分钟溶出油红O溶液，打开多功能酶标仪预热5分钟，在510nm波长下检测各组分吸光度，量化考核各个组分抗肝损伤活性，最终确定组分Fr5的抗肝损伤活性最好；步骤4，MegressC18反相制备柱制备：将组分Fr5加入其体积5倍的甲醇进行溶解，然后加入其体积2倍的硅胶混匀并减压干燥，即可得到Fr5拌样样品；将Fr5拌样样品经MegressC18制备色谱上进行分离，对回收的组分编号并减压干燥，即得Fr5-1、Fr5-2、Fr5-3、Fr5-4、Fr5-5、Fr5-6、Fr5-7、Fr5-8、Fr5-9、Fr5-10、Fr5-11、Fr5-12、Fr5-13、Fr5-14、Fr5-15共15个组分样品；步骤5，抗肝损伤活性组分再筛：将上述15个组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mgmL的样品溶液；将人肝癌细胞HepG2按照2.5×105的密度接种于6孔板，待其贴壁生长至对数生长期后，将各个组分与工作浓度为600μM的油酸加至6孔板中，共孵育24小时；24小时后，弃去培养基，4％甲醛固定细胞15分钟，用蒸馏水洗掉残留4％甲醛后，异丙醇漂洗细胞20秒；油红O染色40分钟；40分钟后蒸馏水洗掉残留油红O染液；异丙醇浸泡细胞40分钟溶出油红O溶液，打开多功能酶标仪预热5分钟，在510nm波长下检测各组分吸光度，量化考核各个组分抗肝损伤活性，最终确定组分Fr5-9的抗肝损伤活性最好；步骤6，ACEExcelC18AR反相制备柱制备：将组分Fr5-9加入其体积5倍的甲醇和水进行溶解，所述甲醇和水的体积比为2:3，然后加入其体积2倍的硅胶混匀并减压干燥，即可得到Fr5-9拌样样品；将Fr5-9拌样样品经ACEExcelC18AR制备色谱上进行分离并减压干燥，即得样品Fr5-9-1；步骤7，抗肝损伤体外活性评价：将样品Fr5-9-1用DMSO配制成浓度为1mM的样品溶液；将人肝癌细胞HepG2按照2.5×105的密度接种于6孔板，待其贴壁生长至对数生长期后，将Fr5-9-1样品溶液与工作浓度为600μM的油酸加至6孔板中，共孵育24小时；24小时后，弃去培养基，4％甲醛固定细胞15分钟，用蒸馏水洗掉残留4％甲醛后，异丙醇漂洗细胞20秒；油红O染色40分钟，40分钟后蒸馏水洗掉残留油红O染液；异丙醇浸泡细胞40分钟溶出油红O溶液，打开多功能酶标仪预热5分钟，在510nm波长下检测吸光度，确定Fr5-9-1具有体外抗肝损伤活性，并命名为FlolutsinA，FlolutsinA化学结构式为：

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百度查询： 中国科学院西北高原生物研究所 黄绿卷毛菇中具有抗肝损伤活性新二肽Flolutsin A的分离工艺及其应用