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申请/专利权人：天津市肿瘤医院(天津医科大学肿瘤医院)

摘要：本发明公开了一种用于检测肿瘤转移种子细胞的免疫组化染色试剂盒及其应用，属用于癌症的免疫化学实验物质的制备。该试剂盒主要包括抑癌分子PRDM16、IGSF9和肿瘤干性分子ALDH2的三种蛋白免疫组化抗体，用于检测来自受试者的离体肿瘤组织中以上三个分子的蛋白表达水平。本发明根据三个分子相应蛋白的表达水平，用于测定肿瘤转移种子细胞，即PRDM16和IGSF9蛋白低失表达、ALDH2蛋白高表达的肿瘤转移种子细胞，为临床精准治疗方案的制定及患者的预后预测提供依据，具有广阔的应用前景。

主权项：1.一种检测乳腺癌肿瘤转移种子细胞的免疫组化染色试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于对离体恶性肿瘤组织中的PRDM16、IGSF9和ALDH2蛋白的表达程度进行检测的人源PRDM16、IGSF9、ALDH2单克隆抗体、免疫组化检测试剂；免疫组化检测试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2、封闭用正常山羊血清工作液、抗体稀释液、生物素标记二抗工作液、DAB显色试剂、辣根过氧化物酶标记链卵白素工作液、苏木素、PBS以及EDTA抗原修复液；该试剂盒的免疫组化检测步骤如下：（a）将制备好的石蜡玻片烤片，然后将玻片放于60℃温箱中过夜；（b）二甲苯脱蜡，20分钟浸泡一次，共三次约60分钟，并用梯度酒精水化；（c）蒸馏水将玻片洗3次，再用PBS缓冲液洗一次；（d）将装有适量EDTA抗原修复液的高压锅加热至沸腾，将准备好的染色用肿瘤组织切片放入高压锅，要确保液体没过切片上的待染色组织；将锅盖盖严，从高压锅开始喷气时计时，2分30秒后停止加热，打开锅盖、室温放置、待切片自然冷却；（e）先用蒸馏水洗切片3次，再用PBS洗1次；（f玻片置入3%过氧化氢中浸泡10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，清水洗净后再用PBS洗1次；（g）取出切片并轻轻擦去组织周围水分，在组织上滴加山羊血清置于室温下封闭30分钟，液体要盖过组织，避免出现非特异性染色；（h弃去血清，不用冲洗，用PBS为阴性对照，直接在组织上滴加稀释好的一抗，放于湿盒中，将湿盒放入4℃冰箱孵育过夜；（i）将湿盒取出后，置于室温复温约60分钟；（j）PBS冲洗3次，每次5分钟；（k）用吸水纸轻轻擦去组织周围水分，在组织上滴加二抗后置于湿盒中37℃温箱孵育30分钟；（l）PBS冲洗3次，每次5分钟；（m）用吸水纸擦去组织周围水分，在组织上滴加辣根过氧化物酶后置于湿盒中37℃温箱孵育30分钟；（n）PBS冲洗3次，每次5分钟；（o）用吸水纸擦去组织周围水分，在组织上滴加新鲜配制并避光保存的DAB，置室温下显色1~3分钟，显微镜下观察显色结果，一旦阳性对照充分显色，即可用流水多次冲洗玻片以终止显色；（p）苏木素复染至3分钟，清水将多余的苏木素洗净，玻片置于盐酸水溶液中数秒进行分化，自来水冲洗，再放入氨水中数秒返蓝，自来水冲洗干净；（q）按80%、95%、100%的酒精浓度梯度进行脱水，之后放入二甲苯中，每次10分钟，进行2次通透，之后用中性树胶进行封片；（r）联合检测评估PRDM16、IGSF9和ALDH2三种蛋白的表达。

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