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申请/专利权人：辽宁省农业科学院

摘要：本发明属于指纹图谱构建技术领域，具体公开了一种烟色离褶伞菌株SLL‑3的KASP标记指纹图谱的构建方法及应用，依次经过菌丝培养、基因组重测序和简化测序、SNP原始文件、统计作图、多样性过滤、同源性过滤、引物设计、KASP标记、标记评估构建得到烟色离褶伞菌株SLL‑3的KASP标记指纹图谱；利用烟色离褶伞菌株SLL‑3的KASP标记指纹图谱对烟色离褶伞菌株进行KASP标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该组指纹图谱一致即为烟色离褶伞菌株SLL‑3。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点。

主权项：1.一种烟色离褶伞菌株SLL-3的KASP标记指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、菌丝培养：将烟色离褶伞菌株SLL-3转接到PDA液体综合培养基上，24℃培养10-12d后收集菌丝；所述烟色离褶伞菌株LyophyllumfumosumSLL-3于2021年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23859,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；S2、基因组DNA的提取：利用真菌DNA提取试剂盒，按照试剂盒实验步骤提取基因组DNA，并取2μLDNA进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测；紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；S3、样品基因组DNA检测合格后，将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检；S4、质检合格的文库用IlluminaNovaseq6000平台进行测序，有效数据用于分析寻找海量SNP标记；S5、SNP位点过滤；S51、SNP位点在染色体上的DNA链上前后大于50bp的序列保守，过滤得到12210个SNP标记；S52、保留平均深度5X及以上、质量值大于30、最小完整度大于0.9、最小等位基因频率大于0.05，且SNP是双等位基因的SNP标记，过滤得到10932个SNP标记；S53、截取过滤得到的10932个SNP标记上下游各100bp序列，然后使用blast软件将序列比对参考基因组，去除比对上多个位置的SNP标记，过滤得到10480个SNP标记；S54、保留多态信息含量PIC大于0.2的SNP标记，过滤得到2744个SNP标记；其中多态信息含量PIC计算公式如下： 其中Pi和Pj是SNP的两个等位基因在所有被测品种中的发生频率，l是样本数量；S6、对过滤得到的2744个SNP标记分别进行引物设计，只有引物设计成功的SNP位点才认为是合格的KASP标记，得到2386个KASP标记；S7、snp位点的的验证以及分型；S71、snp位点的一代验证：基于一代引物进行预实验确认位点的有效性；S72、kasp引物设计结果：对于一代成功的位点进行筛选，根据真实的一代测序设计kasp引物，并进行kasp分型；S73、位点信息整合：将一代引物，kasp引物以及位点的分型信息等进行整合；S8、指纹图谱构建；S81、标记鉴定效率：对2386个KASP标记进行鉴定效率作图；S82、指纹图谱作图：使用Perl语言程序，对2386个KASP标记进行指纹图谱构建。

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