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龙图腾网恭喜广东海洋大学;广东海洋大学深圳研究院;深圳义海生物科技有限公司申请的专利鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116083448B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-03-18发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202211464980.1，技术领域涉及：C12N15/31；该发明授权鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备是由夏立群;陈国权;鲁义善;陈建林;翁婷婷;谭子扬;温依铭;杨惠源设计研发完成，并于2022-11-22向国家知识产权局提交的专利申请。

本鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备在说明书摘要公布了：本发明公开了鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备，利用IVIAT技术获得六个鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因，基于体内诱生抗原制备疫苗，对防治诺卡氏菌病具有一定的免疫保护效果。本发明具有成产成本低廉、易于组成多价疫苗、可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫、安全性较好等优点，能进一步促进诺卡氏菌致病机制的理解，在建立筛选诺卡氏菌病疫苗抗原候选分子的新途径中具有良好的应用。

本发明授权鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因和筛选方法及其疫苗的制备在权利要求书中公布了：1.鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库的构建以1μL、0.5UμLSau3AI酶切鰤鱼诺卡氏菌基因组，所述鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因为IS701familytransposase、molybdopterin-dependentoxidoreductase、membraneproteininsertaseYidC、phosphoketolasefamilyprotein、ergothioneinebiosynthesisglutamate-cysteineligaseEgtA和hypotheticalprotein6747基因，所述鰤鱼诺卡氏菌体内诱生抗原的体内诱导基因的氨基酸序列分别如序列表SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12所示；随后用5μL、10UμL的BamHⅠ内切酶对三种用于构建文库的原核表达载体pET-30abc进行37℃水浴酶切并去磷酸化，利用350UμL的T4DNALigase连接酶，将回收的1-4kb基因组酶切片段与pET-30abc原核表达载体连接并转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，最后把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，稀释后涂布于含100μgmL的Kana+抗生素LB平板，37℃培养24h；利用pET30abc原核表达载体的特异性引物，在鰤鱼诺卡氏菌基因组文库中随机挑取22个大肠杆菌BL21重组克隆菌落，用pET30abc原核表达载体的特异性引物对其进行菌落PCR鉴定，分析酶切片段插入率和大小；S2、杂交鳢感染鰤鱼诺卡氏菌血清的制备用100μL、菌落数1×105CFUmL的鰤鱼诺卡氏菌菌液攻毒杂交鳢7d、15d、30d各取一次血，30d后再次攻毒，隔三天取一次血，共三次；分离血清，将采集的各感染期的血清等体积混合，分装备用；用从培养基收集的鰤鱼诺卡氏菌全菌及其超声破碎处理后的菌体裂解物、和不含基因组文库的大肠杆菌超声破碎处理后的裂解物充分吸收处理血清，以去除鰤鱼诺卡氏菌在宿主体外生存表达的蛋白抗原刺激杂交鳢引起鱼体产生的抗体，获取仅有鰤鱼诺卡氏菌在杂交鳢体内表达的抗原刺激杂交鳢鱼体产生的抗体血清；S3、鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库的免疫筛选用从培养基收集的鰤鱼诺卡氏菌全菌及其超声破碎处理后的菌体裂解物、和不含基因组文库的大肠杆菌超声破碎处理后的裂解物充分吸收处理血清，对鰤鱼诺卡氏菌基因组表达文库进行初步筛选：用无菌棉签将初次筛选的阳性菌落均匀分布接种在含有50µgmL的Kana+抗生素的LB培养基平板上培养，37℃过夜培养，重复初筛步骤过程；收集保存第一次复筛的阳性克隆菌落，用无菌棉签将第一次复筛筛选的阳性菌落均匀分布接种在新的含有50µgmL的Kana+抗生素的LB培养基平板上培养，37℃过夜培养；重复初筛复筛步骤过程，最终得到31个阳性克隆菌落；用pET-30abc原核表达载体的特异性引物扩增阳性克隆菌落进行菌落PCR反应经产物测序后，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，以鰤鱼诺卡氏菌RNA反转录合成的cDNA为模板，检测阳性克隆是否在体外表达，最后获得六个在体外不表达的阳性克隆，分别为IS701familytransposase、molybdopterin-dependentoxidoreductase、membraneproteininsertase、phosphoketolasefamilyprotein、ergothioneinebiosynthesisglutamate-cysteineligaseEgtA和hypotheticalprotein6747基因。

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