申请/专利权人：扬州大学

申请日：2018-06-07

公开（公告）日：2018-11-02

公开（公告）号：CN108728419A

主分类号：C12N7/01(2006.01)I

分类号：C12N7/01(2006.01)I;C12N15/861(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2020.07.17#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.11.27#实质审查的生效;2018.11.02#公开

摘要：本发明涉及表达禽腺病毒penton蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4‑penton及其构建方法，所述新城疫病毒株rAI4‑penton，它的保藏号CGMCC No：15492。其构建方法是利用已建立的新城疫致弱毒株的反向遗传操作平台，将禽腺病毒的penton基因序列插入AI4株基因组全长转录载体pNDVrAI4中，得到重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pNDVrAI4‑penton，经转染获得的重组病毒rAI4‑penton成功表达penton蛋白。重组病毒rAI4‑penton在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传代任能稳定penton蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

主权项：1.表达禽腺病毒penton蛋白的重组新城疫疫苗候选株rAI4‑penton，其保藏号为CGMCC No：15492。

全文数据：表达禽腺病毒penton蛋白重组新城疫疫苗候选株rA14-penton及构建方法技术领域[0001]本发明涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体表达禽腺病毒penton蛋白的重组病毒株rAI4-penton，用于研制疫苗。背景技术[0002]反向遗传学技术是将RNA病毒基因组反转录为cDNA，然后cDNA与各种辅助蛋白相互作用组装成感染性RNA的过程[NeumannG，KawaokaY.Adecadeafterthegenerationofanegative-senseRNAvirusfromclonedcDNA-whathavewelearned?[J].TheJournalofgeneralvirology，2002,83Pt11:2635_62·]，这一过程又被称为“病毒的拯救”。由于反向遗传学技术最终“拯救”的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此可以在DNA的水平上对RNA病毒的基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除缺失）、基因插入、基因置换和基因互补等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[HuangZ，ElankumaranS，PandaA，etal.RecombinantNewcastlediseasevirusasavaccinevector.PoultryScience,2003,82:899-906.]〇[0003]新城疫Newcastledisease，ND是由新城疫病毒Newcastlediseasevirus，NDV引起的主要感染鸡、鸽、鹌鹑、火鸡等家禽和野生禽类的一种急性、败血性、高度接触性传染病。新城疫病毒的基因组为不分节段、单股负链RNA，基因组模式为3’-Ieader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein，NP、磷蛋白（Phosphoprotein，P、基质蛋白（Matrixprotein，M、融合蛋白（Fusionprotein，F、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidaseprotein，HN和大分子蛋白Largeprotein，L。其中F蛋白具有诱导细胞融合、破坏细胞的作用，F蛋白是不同NDV毒力强弱的主要原因，并且F蛋白的裂解位点起到了重要作用[peetersBP，Deleeuw，KochG，etal.RescueofNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA:evidencethatcleavabilityofthefusionproteinisamajordeterminantforvirulence[J].Journalofvirology,1999,736:5001-9.]〇[0004]禽腺病毒Fowladenovirus，FAV属于腺病毒科禽腺病毒属，禽腺病毒的核衣壳由六邻体hexon、五邻体penton和纤丝蛋白（fiber组成。根据群特异性抗原的不同分为3个群：I群禽腺病毒包括从不同禽类分离得到的各血清型毒株，具有形同的群特异性抗原，根据RFLP技术可以分为A-E五个基因型，根据血清交叉中和反应可以分为12个血清型血清型1-7、8、813、9-11，其代表株为鸡胚致死孤儿病毒〇^^0\〇[16111611^1186,011¥代1^B，DecaessteckerMjetal.Phylogeneticanalysisoffowladenoviruses[JC]•Avianpathology:journaloftheWVPA，2004,33⑵：164_70.]Dn群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒HEV、雉鸡大理石脾病MSDV和禽类脾肿大病毒AASV;ΠΙ群禽腺病毒包括减蛋综合征EDSV。其中I群血清4型禽腺病毒FAdV4可以引起包涵体肝炎和心包积液综合征（HPS[KimJN，ByunSH，KimMJ，etal.OutbreaksofhydropericardiumsyndromeandmolecularcharacterizationofKoreanfowladenoviralisolates[J].Aviandiseases,2008,523:526-30.]〇[0005]目前世界各国主要使用灭活油乳剂疫苗预防HPS[DuD，ZhangP，LiX，etal.Cell-culturederivedfowladenovirusserotype4inactivatedvaccineprovidescompleteprotectionforvirusinfectiononSPFchickens[J]•Virusdisease，2017，282:182-8·]，但以这一途径生产的疫苗存在成本高，使用不便，并存在灭活不完全出现扩散病毒的风险，同时弱毒活疫苗又存在基因重组、毒力反强的风险，因此基因重组疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等新型基因工程疫苗成为近几年疫苗研究的热点。[0006]载体病毒最重要的一个特点就是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗，新城疫病毒除具备这一特点外，与同源病毒不发生重组，大量表达外源基因不会引起自身复制的严重减弱，致弱后对人和动物没有致病性，可以作为一种安全载体[BukreyevA,SkiadopoulosMH1MurphyBR,etal.Nonsegmentednegative-strandvirusesasvaccinevectors[J]·JournalofVirology,2006,8021:10293-10306·]。在NDV基因组内插入外源基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达外源蛋白，用此重组病毒作为疫苗，可以诱导机体产生针对外源蛋白和新城疫的双重免疫保护力[VeitsJ,ffiesnerD1Fuchsff,etal.NewcastlediseasevirusexpressingH5hemagglutiningeneprotectschickensagainstNewcastlediseaseandavianinfluenza[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,10321:8197-8202.SchroerD1VeitsJ,GrundC,etal.VaccinationwithNewcastlediseasevirusvectoredvaccineprotectschickensagainsthighlypathogenicH7avianinfluenzavirus[J].AvianDis,2009,532:190-197.]，Lamb等[Lamb，R·A·,Kolakofsky，D.，etal.2001.Paramyxoviridae:thevirusesandtheirreplication^.1305-1340.InD.M.KnipeandP.M.Howley,Fieldsvirology.LippincottffilliamsffilkinsPhiladephia,Pa.]iJf究发现副粘病毒的转录呈极性效应，越靠近3’端的基因其转录产物越多，越靠近5’端转录产物的量越低。从目前研究来看，外源基因在P与M基因之间插入时，其表达量较高，是外源基因插入的首选。2011年胡增磊等对本实验室分离的VDd亚型NDV毒株JS505的F蛋白裂解位点突变后成功构建了全长克隆PNDVAI4,经反向遗传操作获得了致弱AI4,具有优良的繁殖性能，其尿囊液的效价可达到101〇g2,适合作为表达外源基因的载体[HuZ，HuS,MengC,etal.GenerationofagenotypeVIINewcastlediseasevirusvaccinecandidatewithhighyieldinembryonatedchickeneggs[J].Aviandiseases,2011,553:391-7.]〇[0007]禽腺病毒的保护性抗原包括：六邻体（hexon、五邻体（penton和纤丝蛋白fiber，目前还没有以新城疫病毒为载体，表达禽腺病毒外源基因来构建双价疫苗的先例。[0008]penton蛋白是禽腺病毒重要的结构蛋白，参与病毒侵入细胞和病毒粒子组装的过程。有研究表明抗penton蛋白的抗体具有显著的病毒中和作用，能为动物提供90%的保护率[ShahMS,AshrafA,RahmanM,etaI.Asubunitvaccineagainsthydropericardiumsyndromeusingadenoviruspentoncapsidprotein[J]·Vaccine，2012,3050:7153-6.]〇发明内容[0009]本发明的目的在于以NDV为载体表达禽腺病毒penton蛋白的重组病毒株，用于制造疫苗。[0010]本发明表达禽腺病毒penton基因的重组病毒株rAI4_penton，于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号CGMCCNo:15492。[0011]本发明公开所述表达禽腺病毒penton蛋白重组病毒株rAI4-penton的构建方法：以基因W型NDV致弱毒株AI4的基因组全长转录载体pNDVrAI4为骨架，将禽腺病毒的penton基因插入到AI4株基因组全长转录载体pNDVrAI4的P、M基因之间，经反向遗传学技术获得重组病毒rAI4_penton〇[0012]本发明利用已建立的新城疫病毒AI4株的反向遗传操作平台，将扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室分离的一株FAdV4的penton基因插入NDV全长转录载体pNDVrAI4的P、M基因之间，获得重组病毒株rAI4_penton，重组病毒rAI4_penton均具有较高繁殖性能，适合疫苗的大规模生产。[0013]本发明的方法具体包括以下步骤：[0014]1·全长克隆pNDVrAI4_penton的构建[0015]1中间质粒pNAI4-bluntAgeI-BstZ17I的构建[0016]设计引物primerl和primer6，以pNDVrAI4为模板PCR，将产物连入blunt载体，构建得到质粒pNAI4_bluntAgeI_BstZ17I。[0017]Primerl:5’-AACTCTCACAACCGGTGC-3’（SEQIDN0.1[0018]Primer6:5’-CTGAGACGAGGTGTATACATTGACTG-3’（SEQIDN0.6[0019]2禽腺病毒penton基因的克隆[0020]根据GenBank中发表的I株禽腺病毒毒株CHJSXZ2015的全长序列，通过金斯瑞公司合成penton基因，设计引物NAI4-P3和NAI4-P4扩增penton基因编码区（SEQIDN0.9，通过同源重组的方法连入质粒pNAI4-bluntAgeI-BstZ17I中，将测序结果正确的质粒命名为pNAI4-penton-bluntAgeI_BstZ17I〇[0023]3全长克隆pNDVrAI4-penton的获得[0024]质粒pNAI4-penton_BluntAgeI_BstZ17I与质粒pNDVrAI4通过AgeI和BstZ17I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收pNAI4-penton_BluntAgeI-BstZ17I的3428bp的条带和pNDVrAI4的大条带，然后进行连接，构建出重组NDV基因组全长pNDVrAI4-penton，具体构建方法见图1[0025]2·重组病毒pNDVrAI4-penton株的拯救[0026]将全长质粒pNDVrAI4-penton与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个辅助质粒共转染BSR-T75细胞，60h后接种9〜11日龄SPF鸡胚，盲传一代后获得重组病毒rAI4-penton。[0027]本发明以不同新城疫病毒为载体分别插入不同禽腺病毒的保护性抗原六邻体hexon、五邻体penton和纤丝蛋白（fiber，在得到的重组新城疫病毒中，最终只有插入penton基因的重组病毒株能刺激动物产生针对禽腺病毒的中和抗体。[0028]本发明以pNDVrAI4为骨架，构建得到可表达禽腺病毒penton蛋白的重组新城疫病毒株rAI4-penton，成功刺激动物产生了针对新城疫病毒和禽腺病毒的抗体，可用于应对当前新城疫和心包积液的流行。附图说明[0029]图1重组质粒pNDVrAI4-penton构建模式图。[0030]图2重组质粒pNDVrAI4-fiber2构建模式图。[0031]图3重组病毒cDNART-PCR鉴定电泳图。M:IOOObpDNAladdermarker，l:rAI4-penton扩增片段，2:rAI4_fiber2扩增片段。[0032]图4重组质粒感染DFl细胞后外源蛋白的westernblot检测结果。I:Marker，2:rAI4-penton，3:rAI4_fiber2,4:AI4〇[0033]图5免疫后抗NDV病毒的HI抗体水平。[0034]图6免疫鸡血清中抗禽腺病毒中和效价。[0035]图7中间质粒pAI4-2FHN-bluntAgeI-AflΠ构建模式图。[0036]图8重组质粒pNDVrAI4-2FHN-hexon构建模式图。[0037]图9重组病毒外源基因RT-PCR结果。M:IOOObpDNAladdermarker，l:rAI4-2FHN-hexon扩增片段。[0038]图10免疫印迹分析外源蛋白表达情况。1:]\1迚6广2:以14-2卩顯-116叉〇11，3:以14-2FHN-penton，4:rAI4-2FHN-fiber2。[0039]图11免疫后抗载体病毒的HI抗体水平。[0040]图12免疫后抗禽腺病毒中和抗体水平[0041]本发明构建的表达禽腺病毒penton蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4-penton于2018年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为:禽副粘病毒I型;保藏号CGMCCNo.15492。具体实施方式[0042]实施例1:以pNDVrAI4为载体[0043]步骤一：表达禽腺病毒penton蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4-penton全长表达克隆的构建[0044]NDVAI4株的全长表达载体pNDVrAI4HuZ，HuS，MengC，etal.GenerationofaGenotypeVIINewcastleDiseaseVirusVaccineCandidatewithHighYieldinEmbryonatedChickenEggs.AvianDiseases2011,553:1759-1769由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室构建、保存。Blunt载体：购自Transgen公司；DephospharylationBAPKit:购自宝生物工程（大连）有限公司；AMV反转录酶、HighfidelityDNApolymerase、T4DNA连接酶、AgaroseGelDNAExtractionKit购自Roche公司；转染试剂SuperFect和质粒抽提试剂盒QIAprepSpinMiniPrepKit为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。[0045]1、中间质粒pNAI4-bluntAgeI-BstZ17I的构建[0046]根据质粒pNDVrAI4的序列设计引物primerl和primer6,用于扩增质粒pNDVrAI4酶切位点AgeI2879-BstZ17I4705之间的序列。引物序列如下：[0047]Primerl:5’-AACTCTCACAACCGGTGC-3’（SEQIDN0.1[0048]Primer6:5’-CTGAGACGAGGTGTATACATTGACTG-3’（SEQIDN0.6[0049]引物序列中加粗部分为酶切位点序列，斜体部分为同源序列，以上引物由上海生物工程有限公司合成。[0050]PCR反应以质粒pNDVrAI4为模板配置如下体系：[0053]PCR反应程序：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min，进行15个循环;94°：变性3〇8,56°：退火3〇8,72°：延伸21^11，进行15个循环;72°：延伸1〇111丨11，41€保存。[0054]琼脂糖凝胶电泳后切割1852bp的条带，回收per产物后于4摄氏度保存。[0055]PCR产物回收纯化后与blunt载体连接，转化入DH5a感受态，提取的质粒用Primerl和Primer6进行PCR验证，阳性质粒命名为pNAI4_bluntAgeI_BstZ17I。[0056]2、禽腺病毒penton基因的克隆[0057]通过金斯瑞公司合成禽腺病毒毒株CHJSXZ2015GenBank:KU569296.1的penton基因，根据penton基因序列设计引物NAI4-P3和NAI4-P4,用于扩增penton基因的编码区。根据pNDVrAI4的序列设计引物Primerl、Primer2、Primer5、Primer6用于进行同源重组反应。[0059]引物序列中，加粗部分为酶切位点序列，下划虚线为kozak序列，可以提高外源基因的表达水平，下滑实线为新城疫病毒的GE和GS序列，斜体部分为引物上的同源序列，引物由南京金丝瑞公司合成。以Primerl和Primer2为引物扩增pNDVrAI4的2879位AgeI至3114位PacI之间的片段，以NAI4-P3和NAI4-P4为引物扩增以penton基因的ORF片段，?411^^5和?411^^6为引物扩增口_¥^14的3114位屮331至4705位出8七2171之间的片段，将质粒pNAI4-bluntAgeI-BstZ17I使用AgeI和BstZ17I进行双酶切来暴露出同源臂，回收载体片段，以上3个PCR片段与载体片段利用同源序列进行同源重组反应可以构建得到质粒pNAI4-penton_bluntAgeI_BstZ17I;将质粒pNAI4-penton_bluntAgeI_BstZ17I通过AgeI和BstZ17I双酶切连入全长质粒pNDVrAI4中，可得到重组病毒全长质粒pNDVrAI4-penton〇[0060]PCR反应体系：[0062]PCR反应程序:94°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，进行15个循环；94°C变性30s，58°C退火3〇8,72°：延伸3〇8，进行15个循环；72°：延伸1〇111丨11，4°：保存。[0063]对NAI4-P3和NAI4-P4这对引物扩增的片段进行测序，获得penton蛋白的基因序列，S卩SEQIDNO.7所示序列：[0064]将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可分别得到265bp、1794bp和1603bp的目的条带，将目的条带用胶回收试剂回收后放置于4°C备用。[0065]将质粒pNAI4-BluntAgeI-BstZ17I用AgeI和BstZ17I进行双酶切，回收3982bp条带，与265bp、1794bp和1603bp的条带条带通过InFusionAdvantagePCRCloningKit试剂盒进行连接，转化入DH5a感受态细胞，提取的质粒送南京金丝瑞公司测序，测序结果正确的质粒命名为pNAI4-penton_bluntAgeI_BstZ17I〇[0066]3、全长克隆pNDVrAI4_penton的构建[0067]质粒pNAI4-penton_bluntAgeI_BstZ17I与质粒pNDVrAI4通过AgeI和BstZ17I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收pNAI4-penton_bluntAgeI-BstZ17I的3428bp的条带和pNDVrAI4的大条带，然后进行连接，转化入DH5a感受态细胞，鉴定阳性的质粒命名为pNDVrAI4_penton。（见图1[0068]步骤二：表达禽腺病毒fiber2蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4-fiber2全长表达克隆的构建[0069]1、禽腺病毒fiber2基因的克隆[0070]通过金斯瑞公司合成禽腺病毒毒株CHJSXZ2015的fiber2基因，GenBank序列号为KU569296.1，根据fiber2基因序列设计引物NAI4-F3和NAI4-F4,用于扩增fiber2基因的编码区。根据口冊¥^14的序列设计引物?1'；[11161'1、？1'；[111612、？1'；[111615、？1'；[1116押用于进行同源重组反应。[0072]引物序列中，加粗部分为酶切位点序列，下划虚线为kozak序列，可以提高外源基因的表达水平，下滑实线为新城疫病毒的GE和GS序列，引物由上海生物工程有限公司合成。[0073]PCR反应体系：[0075]PCR反应程序:94°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，进行15个循环；94°C变性30s，58°C退火3〇8,72°：延伸3〇8，进行15个循环；72°：延伸1〇111丨11，4°：保存。[0076]对NAI4-F3和NAI4-F4这对引物扩增的片段进行测序，获得fiber2蛋白的基因序列，S卩SEQIDNO.10所示序列：[0077]将质粒pNAI4-bluntAgeI-BstZ17I用AgeI和BstZ17I进行双酶切，暴露同源臂，回收3982bp条带，与步骤一中的方法一样，将fiber2基因通过同源重组连入载体，将得到的质粒测序，测序结果正确的质粒命名为口嫩144让6^-131111^0861-88七2171。[0078]2、全长克隆pNDVrAI4-fiber2的构建[0079]质粒pNAI4-fiber2_bluntAgeI_BstZ17I与质粒pNDVrAI4通过AgeI和BstZ17I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳回收口财144讣6^-131111^仏861-88七2171的3428匕？的条带和pNDVrAI4的大条带，然后进行连接，转化入DH5a感受态细胞，鉴定阳性的质粒命名为pNDVrAI4-fiber2见图2。[0080]步骤三:重组病毒rAI4_penton株和rAI4_fiber2株的拯救[0081]可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T75细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。CEF细胞由实验室按常规方法自行制备。[0082]真核表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L胡顺林，张艳梅，孙庆，刘玉良等.鹅源新城疫病毒拯救体系的建立[J].微生物学通报.2007，34⑶）：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。其中，表达NP和P基因的真核表达质粒pCI-NP、pCI-P还公开于刘玉良.（2005.从cDNA克隆产生感染性ZJl株鹅源新城疫）；表达L基因的真核表达质粒pCI-L还公开于胡顺林.（2007.鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其应用）。[0083]SPF种蛋购自北京梅里亚公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。[0084]1、重组病毒的拯救[0085]转染时所用质粒（全长质粒、pCI-NP、pCI_P和pCI-L均采用QIApr印SpinMiniPrepKit抽提。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L3个辅助质粒分别与重组NDV基因组全长cDNA克隆pNDVrAI4-penton和pNDVrAI4-fiber2共转染BSR-T75细胞，18-24h后加入终浓度为10%SPF胚尿囊液，96h后将转染样品冻融1次后，收获并接种9〜11日龄SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，按OIE标准测定血凝效价，获得表达禽腺病毒蛋白的重组新城疫疫苗候选株rAI4_penton和rAI4_fiber2。两株重组病毒的血凝特性能被针对NDV的多克隆抗体抑制。[0086]rAI4-penton株在鸡胚上传代5次后，所测HA效价为91og2,与母本毒株AI4相比下降了1个滴度，而重组病毒rAI4-fiber2株HA效价为Hog2，与AI4株相比下降了2个滴度，fiber2基因的插入更加明显的抑制了新城疫病毒的复制。[0087]2、RT-PCR验证获救重组病毒[0088]红细胞凝集试验（hemaggIutinatiοη，HA和红细胞凝集抑制实验hemagglutinationinhibition,HI检测均为阳性的尿囊液，在SPF鸡胚上传4代后，收集尿囊液抽提病毒的总RNA，用6nt随机引物反转录成cDNA后用于RT-PCR反应。[0089]用引物Primerl和AI4a扩增penton和fiber-2,长度分别为2044bp和1906bp，将PCR产物回收并测序结果，表明外源基因通过反向遗传学成功插入到新城疫病毒载体中。（见图3[0092]步骤四：重组病毒的生物学特性鉴定[0093]1、MDT的测定[0094]鸡胚平均致死时间（meandeathtime，MDT测定：用灭菌生理盐水将重组病毒分别作10倍（1〇_6、HT7……10_1°梯度稀释，每个稀释度接种5枚9〜11日龄SPF鸡胚，每胚0.ImL，同时设置5枚接种生理盐水的鸡胚作为对照。37°C孵育，弃去24h内死亡的鸡胚，之后每隔12h观察一次直至120h，按OIE标准方法计算病毒的MDT。[0095]结果：重组病毒在5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有死亡，表明重组病毒rAI4-penton和rAI4_fiber2的MDT值大于120h。[0096]2、Westernblot试验[0097]将重组病毒“14-?6的〇11、“144讣6^以》1=1的剂量接种0?1细胞，感染2411后裂解细胞收集胞浆蛋白同时裂解未感染病毒的鸡胚成纤维细胞作为空白对照。处理后的样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印到0.22um孔径PVDF膜上，5%脱脂乳封闭，以鸡源抗禽腺病毒多抗血清作为一抗，HRP标记的兔抗鸡IgG为二抗进行抗原抗体结合反应。用ECL发光法显色，用凝胶成像系统采集信号。[0098]结果：重组病毒rAI4_penton和rAI4_fiber2分别成功表达出penton蛋白和fiber2蛋白（见图4。[0099]步骤五:疫苗载体株的免疫效力试验[0100]将1日龄SPF鸡随机分组，10只组，进行隔离饲养，经滴鼻点眼分别接种载体疫苗rAI4-penton和rAI4-fiber2，剂量为IO6EID5q只，同时设AI4接种组作为空白对照，PBS接种组作为阴性对照。每只试验鸡免疫后3周采集静脉血，检测针对NDV和禽腺病毒的血清转化水平。[0101]结果:免疫鸡群未表现出任何临床症状，说明重组病毒株对鸡不致病，可以安全使用。重组病毒rAI4-penton和rAI4-fiber2接种动物后均能刺激动物产生针对新城疫病毒的抗体，HI效价在41og2以上详见图5;rAI4-pent〇n病毒株在SPF鸡中能有效地刺激产生抗禽腺病毒的抗体;但是rAI4-fiber2病毒株免疫动物后没有检测到针对禽腺病毒的中和抗体，怀疑由于fiber2基因的插入导致重组病毒rAI4-fiber2的繁殖性能下降，导致其免疫原性降低详见图6。[0102]实施例二：以pNDVrAI4-T4FHN为载体[0103]质粒pNDVrAI4-T4FHN的保藏号为CGMCCNo:12987,已由中国专利申请201710596136.7公开。[0104]步骤一:表达禽腺病毒hexon蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4-2FHN-hexon全长表达克隆的构建[0105]1、中间质粒pAI4-2FHN-bluntAgeI-BstZ17I的构建[0106]参照pNDVrAI4-T4FHN设计引物如下：[0108]引物序列中加粗部分为酶切位点序列，斜体部分为重叠序列，引物交由金丝瑞公司合成。[0109]以pNDVrAI4-T4FHN为模板进行PCR反应：[0111]PCR反应程序：94°C预变性5min;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸4min，进行15个循环;94°：变性3〇8,54°：退火3〇8,72°：延伸41^11，进行15个循环;72°：延伸1〇1^11，41€保存。[0112]电泳后切割3371bp的条带，PCR产物回收纯化后与BluntZero载体连接，转化入DH5a感受态，提取的质粒用Primerl和FHa进行PCR验证，阳性质粒命名为pAI4-2FHN-bluntAgeI-Afin。构建流程可见图7。[0113]2、禽腺病毒hexon基因的克隆[0114]通过金斯瑞公司合成禽腺病毒毒株CHJSXZ2015的hexon基因，GenBank序列号为KU569296.1，根据hexon基因序列设计引物NAI4-H3和NAI4-H4,用于扩增hexon基因的编码区。根据pNDVrAI4_T4FHN的序列设计引物Primerl、Primer2、Primer5、FHa用于进行同源重组反应。[0117]引物序列中，加粗部分为酶切位点序列，下划虚线为kozak序列，可以提高外源基因的表达水平，下滑实线为新城疫病毒的GE和GS序列，引物由上海生物工程有限公司合成。[0118]PCR反应体系：[0120]PCR反应程序:94°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，进行15个循环；94°C变性30s，58°C退火3〇8,72°：延伸3〇8，进行15个循环；72°：延伸1〇111丨11，4°：保存。[0121]对NAI4-H3和NAI4-H4这对引物扩增的片段进行测序，获得hexon蛋白的基因序列，即SEQIDNO.16所示序列：[0122]将质粒pAI4-2FHN-bluntAgeI-AflΠ用AgeI和AflΠ进行双酶切，暴露同源臂，回收3982bp条带，与步骤一中的方法一样，将hexon基因通过同源重组连入载体，将得到的质粒测序，测序结果正确的质粒命名为pNAI4-2FHN-hexon-bluntAgeI-AflΠ。[0123]2、全长克隆pNDVrAI4-2FHN-hexon的构建[0124]质粒pNAI4-2FHN-hexon_bluntAgeI-AflΠ与质粒pAI4_2FHNAgeI-FspAI通过PacI和AflΠ双酶切，回收目的片段后进行连接反应，连接成功的质粒命名为pNAI4-2FHN-hexonAgeI-FspAI〇[0125]将pNDVrAI4和pNAI4-2FHN_hexonAgeI-FspAI通过PacI和FspAI双酶切，回收目的片段后进行连接反应，连接结果鉴定为阳性的质粒命名为pNDVrAI4-2FHN-hexon，阳性质粒保存在_70°C。构建流程可见图8。[0126]步骤三:重组病毒rAI4-2FHN-hexon的拯救[0127]可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T75细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。CEF细胞由实验室按常规方法自行制备。[0128]真核表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI_L胡顺林，张艳梅，孙庆，刘玉良等.鹅源新城疫病毒拯救体系的建立[J].微生物学通报.2007，34⑶）：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。其中，表达NP和P基因的真核表达质粒pCI-NP、pCI-P还公开于刘玉良.（2005.从cDNA克隆产生感染性ZJl株鹅源新城疫）；表达L基因的真核表达质粒pCI-L还公开于胡顺林.（2007.鹅源新城疫病毒反向遗传技术平台的建立及其应用）。[0129]SPF种蛋购自北京梅里亚公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。[0130]1、重组病毒的拯救[0131]转染时所用质粒（全长克隆、pCI-NP、pCI-P和pCI-L均采用QIApr印SpinMiniPrepKit抽提。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L3个辅助质粒分别与重组NDV基因组全长。0嫩克隆“14-2?圆-1^^〇11共转染831^175细胞，18-2411后加入终浓度为10%3??胚尿囊液，96h后将转染样品冻融1次后，收获并接种9〜11日龄SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，按OIE标准测定血凝效价，获得表达禽腺病毒蛋白的重组新城疫疫苗候选株rAI4-2FHN-hexon〇[0132]2、RT-PCR验证获救重组病毒[0133]红细胞凝集试验（hemaggIutinatiοη，HA和红细胞凝集抑制实验hemagglutinationinhibition,HI检测均为阳性的尿囊液，在SPF鸡胚上传4代后，收集尿囊液抽提病毒的总RNA，用6nt随机引物反转录成cDNA后用于RT-PCR反应。[0134]用引物NAI4-H3和NAI4-H4扩增hexon，长度为2852bp，将PCR产物回收并测序结果，表明外源基因通过反向遗传学成功插入到新城疫病毒载体中。（见图9[0135]步骤三:重组病毒的生物学特性鉴定[0136]1、MDT的测定[0137]鸡胚平均致死时间（meandeathtime，MDT测定：用灭菌生理盐水将重组病毒分别作10倍（1〇_6、HT7……10_1°梯度稀释，每个稀释度接种5枚9〜11日龄SPF鸡胚，每胚0.ImL，同时设置5枚接种生理盐水的鸡胚作为对照。37°C孵育，弃去24h内死亡的鸡胚，之后每隔12h观察一次直至120h，按OIE标准方法计算病毒的MDT。[0138]结果：重组病毒在5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有死亡，表明重组病毒rAI4-2FHN-hexon的MDT值大于120h。[0139]2、Westernblot试验[0140]将重组病毒rAI4-2FHN-hexon以MOI=I的剂量接种DFl细胞，感染24h后裂解细胞收集胞浆蛋白同时裂解未感染病毒的鸡胚成纤维细胞作为空白对照。处理后的样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转印到0.22um孔径PVDF膜上，5%脱脂乳封闭，以鸡源抗禽腺病毒多抗血清作为一抗，HRP标记的兔抗鸡IgG为二抗进行抗原抗体结合反应。用ECL发光法显色，用凝胶成像系统采集信号。[0141]结果：以相同的构建策略共构建出三株重组病毒:rAI4-2FHN-hexon、rAI4-2FHN-penton、rAI4_2FHN-fiber2。均以AI4-T4FHN为载体分别插入了hexon、penton和fiber2基因，重组病毒rAI4-2FHN-hexon没有表达出hexon蛋白，但是重组病毒rAI4-2FHN-penton和rAI4_2FHN-fiber2成功表达出了penton蛋白和;1^;^6『2蛋白，116叉〇11基因长度为281仙卩，penton基因和fiber2基因长度分别为1578bp和1440bp，可能由于hexon基因太大，超出了新城疫病毒载体表达外源基因的上限见图10。[0142]步骤五:疫苗载体株的免疫效力试验[0143]将1日龄SPF鸡随机分组，10只组，进行隔离饲养，经滴鼻点眼分别接种载体疫苗rAI4-2FHN-hexon、rAI4-2FHN-penton、rAI4-2FHN-hexon剂量为IO6EID5Q只，同时设PBS接种组作为对照。每只试验鸡免疫后3周采集静脉血，检测针对禽腺病毒的血清转化水平。[0144]结果:免疫鸡群未表现出任何临床症状，说明重组病毒株对鸡不致病，可以安全使用。重组病毒接种动物后检测到了针对载体新城疫病毒AI4-T4FHN的HI抗体，表明重组病毒能在动物体内进行有效复制详见图11。[0145]rAI4-2FHN-penton重组病毒刺激动物产生了中和抗体，但rAI4-2FHN-hexon和rAI4-2FHN-fiber2免疫组没有检测到针对禽腺病毒的中和抗体，我们认为由于重组病毒rAI4-2FHN-heX〇n没有表达出hexon蛋白，因此免疫动物后没有产生针对禽腺病毒的中和抗体；由图11可以看出在免疫后三周rAI4-2FHN-fiber2刺激动物产生的抗体水平最低，因此fiber2蛋白的表达降低了载体病毒的复制能力，从而导致rAI4-2FHN-fiber2病毒没有刺激动物产生抗禽腺病毒的中和抗体详见图12。[0146]实验结果表明只有插入penton基因的重组病毒rAI4_penton和rAI4-2FHN_penton能刺激动物产生针对禽腺病毒的中和抗体，由于rAI4-2FHN-penton所使用的载体病毒为嵌合新城疫病毒AI4-T4FHN，其F和HN蛋白来源于禽副粘病毒血清2型，与禽副粘病毒血清1型的新城疫病毒具有血清型差异，无法为动物提供针对新城疫病毒的免疫保护;而重组病毒rAI4-penton其F和HN蛋白来源于禽副粘病毒血清1型，免疫动物后产生的新城疫抗体HI效价高于41og2,因此可用来预防新城疫病毒和禽腺病毒的感染。

权利要求：1.表达禽腺病毒penton蛋白的重组新城疫疫苗候选株rAI4-penton，其保藏号为CGMCCNo:15492。2.权利要求1所述表达禽腺病毒penton蛋白的重组新城疫疫苗候选株rAI4-penton的构建方法，其特征在于：以新城疫致弱毒株为载体，表达禽腺病毒penton蛋白。

百度查询： 扬州大学 表达禽腺病毒penton蛋白重组新城疫疫苗候选株rAI4-penton及构建方法

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