申请/专利权人：中山大学

申请日：2015-07-28

公开（公告）日：2016-04-13

公开（公告）号：CN105483087A

主分类号：C12N5/10(2006.01)I

分类号：C12N5/10(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.07.02#未缴年费专利权终止;2018.08.24#授权;2016.05.11#实质审查的生效;2016.04.13#公开

摘要：本发明提供了一株新的人支气管上皮细胞株HBE-TT。该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心武汉，保藏编号为CCTCC NO:C201560。经鉴定，HBE-TT细胞株纯度良好，无杂细胞污染，并且区别于现有的其它所有细胞株。此外，该永生化细胞保留了原代支气管上皮细胞的典型特征，无支原体污染，并且未呈现恶性转化特征，提示HBE-TT细胞在体外传代培养过程中可以保持性状稳定。HBE-TT细胞有望成为深入探讨环境有害因素暴露所导致的肺部疾病发生发展的分子机制和药理学研究的有力工具，对探究环境有害因素对人体肺脏的健康损害效应、风险评估、以及新药开发有重要意义。

主权项：一种人支气管上皮细胞株，其特征在于，命名为人支气管细胞系HBE‑TT，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201560。

全文数据：一种人支气管上皮细胞株HBE-TT技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及永生化人支气管上皮细胞株。背景技术[0002]人支气管上皮细胞humanbronchialepithelialcells，HBE是人体与外界环境接触的第一道屏障，在环境有害因素引起的多种肺部疾病的发生、发展过程中起重要作用，例如肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、肺囊性纤维化等。体外培养的人支气管上皮细胞在形态结构、生物学功能等方面与体内原组织有较好的相似性，人源细胞培养技术对体外研究的开展起到关键的作用。由于原代细胞在体外培养一定时间会出现衰老死亡，因此必须建立永生化细胞株。永生化人支气管上皮细胞株的构建为阐明疾病的发生、发展机制，以及新药开发等体外研究提供了非常有利的研究工具和手段。[0003]目前获得永生化细胞株的方法主要有:化学致癌物诱导法、病毒基因导入法、以及直接利用癌组织分离永生化细胞株方法等。其中，经化学致癌物诱导得到的细胞株和癌组织来源的细胞虽然能够在体外长期培养，但是这些恶性转化的细胞由于基因组发生了不明确的显著变异，使其在分子机制研究中的应用受到制约。病毒基因导入法是诱导人原代细胞永生化常用的方法之一，目前最为常用的病毒基因有人乳头瘤病毒16humanpapillomaviruses，HPV16或人乳头瘤病毒18humanpapillomaviruses，HPV18的E6E7基因、以及猿猴病毒40早期DNA序列区编码大T抗原（largeTantigen，LT。美国模式培养物保藏中心AmericanTypeCultureCollection，ATCC登录在案的永生化人支气管上皮细胞均是通过向原代细胞导入上述病毒基因获得。临床研究发现，乳头瘤病毒可以感染人支气管上皮组织并诱导恶性转化，向原代细胞导入该基因可以使细胞在体外能够被长期传代培养，但是同时也增加了细胞恶性转化的风险。相比之下，SV40病毒则被认为不具成瘤性，通过SV40病毒基因永生化的细胞可以用于致癌相关研究。尽管如此，SV40病毒基因的这一特性仅仅局限于细胞株建立的早期，随着体外传代次数的增多，这些永生化细胞株或细胞系也一样会表现出一定的恶性特征，这些细胞特性会影响实验数据的准确性。因此，利用SV40病毒基因构建新的人支气管上皮细胞株，应用早代的细胞进行科学研究，将大大提高研究数据的真实性和可靠性。[0004]根据体外细胞衰老的分子机理和“端粒假说”，人体细胞在培养过程中由于端粒的逐渐缩短，细胞进入衰老为特征的危机期，如果抑癌基因P53和pRB基因失活以及细胞端粒酶激活则可以逃脱衰老威胁，使人体细胞获得永生化。发明内容[0005]本发明的目的在于提供一种永生化人支气管上皮细胞株，该细胞株不仅维持了人支气管上皮细胞的正常特征，且无恶性转化特征。[0006]本发明为达到其目的，所采用的技术方案是:提供一种人支气管上皮细胞株，命名为人支气管细胞系HBE-TT，于2015年6月11日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC中国武汉），保藏编号为CCTCCN0:C201560。[0007]所述人支气管细胞系HBE-TT在镜下观察其形态呈多边形。[0008]所述人支气管细胞系HBE-TT的细胞倍增时间为44.5±2.7h。[0009]所述人支气管细胞系HBE-TT的蛋白表达特征为:LT蛋白阳性表达，角蛋白阳性表达，肌动蛋白阴性表达。[0010]经STR鉴定，结果显示，本发明的人支气管细胞系HBE-TT有别于现有其它所有细胞系，是一个新的细胞株，并且未遭受杂细胞污染，以及其他病原微生物污染。[0011]本发明还提供上文所述的人支气管细胞系HBE-TT的子代细胞。[0012]本发明的人支气管细胞系HBE-TT或称为人支气管细胞系HBE-TT为通过如下方式获得:①采用组织贴块法，从正常支气管组织分离培养原代人支气管上皮细胞;②通过逆转录病毒基因转染技术在原代细胞中高表达SV40LT和人端粒催化亚基基因（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT使细胞永生化。[0013]本发明提供的永生化细胞株人支气管细胞系HBE-TT是一株接近正常人支气管上皮细胞的细胞株，无恶性转化特征，其有望成为研究环境有害因素对人体肺脏的毒性效应及机制、以及相关药理学的有力工具，可用于以下研究领域:①毒理学体外试验，如环境化学物或药物靶细胞毒性试验;②体外实验研究，如肿瘤发生和药物毒物的作用机制研究或药敏筛查试验;③不同因素作用诱导细胞恶性转化模型可用于新药开发筛查。附图说明[0014]图1:光镜下人原代支气管上皮细胞形态学观察；[0015]图2:光镜下永生化代支气管上皮细胞HBE-TT形态学观察；[0016]图3:LT蛋白表达结果；[0017]图4=HBE-TT细胞生长曲线；[0018]图5:角蛋白（cytokeratin表达；[0019]图6:肌动蛋白α-SMA表达；[0020]图7:支原体污染检测结果；[0021]图8:裸鼠成瘤，图8中左图为阳性对照SMMC细胞裸鼠成瘤情况，右图为HBE-TT裸鼠成瘤情况；[0022]图9:STR分析结果。具体实施方式[0023]下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明：[0024]实施例中所用到的原料或者试剂除特别说明之外，均市售可得。文中除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。[0025]实施例中所用部分原料说明如下：人支气管上皮细胞培养基（商品名AirwayEpithelialCellGrowthMedium，C_21060,即用型，购自PromoCell公司）；人支气管上皮细胞冻存液（商品名SerumFree-CellFreezingMedium，简称SF_CFM，CatalogNumber:0143，购自ScienCe11公司）；DMEM基础培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素链霉素双联抗生素均购自GIBCO公司；病毒浓缩液购自SBI公司，LT一抗购自BD公司;β-actin—抗、角蛋白一抗、肌动蛋白一抗、DAPI、胶原包被液、秋水仙素均购自sigma-Aldrich公司。[0026]实施例中所用部分仪器说明如下:02恒温培养箱ESC0,新加坡），台式低温离心机Eppendorf，德国），液氮罐STATEB0URNE，英国），细胞计数仪BECKMAN，美国），倒置荧光显微镜Nikon，日本），倒置显微镜Leica，德国），生物安全柜；ESC0,新加坡），垂直电泳槽Hofer，美国），电转仪Bio-Rad，美国）。[0027]实施例1人支气管细胞系HBE-TT的制备[0028]1.1原代支气管上皮细胞的获取和培养[0029]支气管组织来源：为患者在进行治疗前，经开胸术采集的病变组织旁边的正常组织。该患者为男性，汉族，诊断患有肺癌，了解并理解研究目的与内容，签署知情同意书。样本采集经中山大学伦理委员会批准，废弃样本严格按照生物性污染物处理原则和程序处理。[0030]将获得的人支气管正常组织立即用预冷的DMEM培养基保存，并于半小时内带回实验室。用含双抗青霉素链霉素双联抗生素）的冷PBS清洗管腔内的黏液和淤血，去除结缔组织，将支气管组织切割成0.5cmX0.5cm的小组织块。用手术刀在预先用30ygmL胶原包被液包被的培养皿刻多个“十”字，在皿中加入适量人支气管上皮细胞培养基。将前面所述的小组织块内壁朝下，贴在“十”字上。将培养皿放在37°C培养箱中，每4天换液。大约两周，细胞融合度达到80%左右。用0.25%胰酶消化，将细胞悬液接种到新的培养皿，于37°C培养箱中继续培养，获得人原代支气管上皮细胞或称为原代HBE细胞）。[0031]1.2细胞永生化[0032]1.2.1接种并转染包装细胞人胚肾上皮细胞293T细胞）[0033]以lX106皿的密度接种293T细胞于10cm培养皿，24h后将pBABE-neo空载体）、pBABE-neo-IargeTcDNA、pBabe_hyg-hTERT和pCL-ampho四种质粒的浓度统一调整为lygyL，然后用FuGENE-6进行转染，按如下比例配制反应体系：pBabe-hyg-hTERT或:pBABE-neo-largeTeDNA或ρΒ.ΑΒΕ-·〇5μ!^pCL-Ampho5|iL[0034]FuGENE-615μΙ,DMEM不含血清和抗生素）75μί.总计IOOpL[0035]其中含pBABE-neo的转染体系配制两份，pBabe-hyg-hTERT和pBABE-neo-IargeTcDNA各配制一份共四份），配好后轻弹离心管壁混匀，室温静置30min，之后将各个管的混合液分别逐滴滴入四皿293T细胞培养基中进行转染。24h后将293T细胞培养基小心吸出并弃入含漂白粉消毒液中灭活可能存在的病毒，向293T细胞培养皿加入新鲜DMEM完全培养基。[0036]本实验中所用高表达质粒载体pBABE-nec^pBABE-neo-largeTcDNANpBabe-hyg-hTERT和pCL-ampho,以及人胚肾上皮细胞（293T细胞）均由美国哈佛大学医学院WilliamHahn教授赠送。这些质粒和细胞也可以通过市场购买获得，其中，pBabe-hyg-hTERT可用其他质粒例如pBabe-puro-hTERT替代。[0037]1.2.2接种靶细胞原代HBE细胞）[0038]待1.2.1中转染293T细胞约20h后，将指数生长期的原代HBE细胞接种于六孔板中5XIO4个孔），培养所用培养基为人支气管上皮细胞培养基。[0039]1.2.3收集病毒上清液并感染靶细胞[0040]待1.2.2的靶细胞原代HBE细胞接种24h后，收集1.2.1中293T细胞的培养基，经〇.45μΜ滤膜过滤后用病毒浓缩液进行浓缩，用人支气管上皮细胞培养基溶解后感染原代支气管上皮细胞。其中，将含有LT和hTERT的病毒进行混合后对靶细胞进行感染。为保持病毒滴度一致，将两份空载体病毒混合后对另一份靶细胞进行感染。进行感染时靶细胞需要达到约30-50%的生长融合度。8h后将旧培养基弃掉，换以新鲜人支气管上皮细胞培养基。次日再以同样方法感染靶细胞一次，并于感染后8h换液。之后，将细胞常规传代培养。[0041]1.2.4阳性细胞筛选[0042]将1.2.3中经两次感染后的细胞传代，因导入LT和hTERT发生永生化的细胞具有无限传代能力，否则细胞传代能力有限，故经过传代培养可以自然筛选出永生化细胞，需历时约1〜2月，当对照细胞感染空载体病毒的细胞衰老死亡，而导入LT和hTERT的细胞则可以继续传代培养每3〜4天传代一次）时，便可认定细胞发生永生化。永生化的细胞经后期进一步鉴定可以予以确认，并命名为HBE-TT，该永生化细胞于2015年6月11日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC中国武汉），保藏编号为CCTCCN0:C201560。[0043]对筛选所得阳性细胞（即永生化的细胞进行形态学观察:在镜下观察发现，本发明的永生化细胞人支气管细胞系HBE-TT和人原代支气管上皮细胞在形态学上无明显差异，均呈多边形，结果分别见图1〜2。[0044]实施例2人支气管细胞系HBE-TT的LT蛋白表达检测[0045]对实施例1筛选所得阳性细胞人支气管细胞系HBE-TT通过蛋白印迹技术做进一步鉴定。[0046]该实验以高表达SV40LT的细胞株作为检测LT的阳性对照，阳性对照所用细胞株只要具有高表达SV40LT特性即可，可以采用现有的具有该特性的细胞株作为阳性对照所用细胞株，例如美国典型培养物保藏中心ATCC的人支气管上皮细胞，商品货号为NL20ATX#、CRL2503™，这种高表达SV40LT基因的人支气管上皮细胞也可以作为阳性对照。本实施例中具体采用的是本实验室保存的高表达SV40LT基因的HEK细胞HahnWC，DessainSK,BrooksMff1KingJE1ElenbaasB,SabatiniDM,DeCaprioJA,WeinbergRA.Enumerationofthesimianvirus40earlyregionelementsnecessaryforhumancelltransformation.MolCellBiol.2002Apr；227:2111-23.Erratumin:MolCellBiol2002May;2210:3562.作为检测LT的阳性对照，以肺癌组织来源的肿瘤细胞株A549为阴性对照。[0047]实验方法:待细胞融合度达80%-90%时吸走培养基，用预冷的I3BS漂洗细胞2次，用细胞刮小心地将细胞刮下，利用NP40裂解细胞，4°C于12000转离心20min，吸取上清液。用碧云天公司BCA试剂盒进行蛋白质定量。用10%丙烯酰胺的分离胶分离蛋白，电泳结束后利用电转系统将蛋白转至PVDF膜。用PBST洗膜2次，每次4min。然后用5%的脱脂奶粉封闭2小时，用I3BST漂洗2次，每次5min。之后以1:2000加入LT一抗小鼠抗人），4°C过夜，以β-actin1:5000稀释，小鼠抗人作为内参。用I3BST漂洗3次，每次6min。之后加二抗室温孵育1小时，用PBST漂洗3次，每次6min。以ECL试剂盒进行显色，以X光胶片进行曝光。显影、定影后用自来水冲洗干净，晾干并扫描。[0048]通过免疫印记法检测永生化细胞HBE-TT中LT蛋白的表达情况，发现HBE-TT与阳性对照细胞均表达LT蛋白，结果见图3,证实HBE-TT细胞中高表达LT蛋白。[0049]实施例3细胞生长特性[0050]将人支气管细胞系HBE-TT细胞接种到24孔板，每孔接种5XIO4个细胞，设3个平行样，所用培养基为人支气管上皮细胞培养基，于48h、72h、96h进行计数。以观察天数为横坐标，以细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。计算倍增时间，细胞倍增时间指细胞数目增加一倍的时间，能较好地反映细胞的生长状况。用下述公式计算细胞倍增时间。其中，TD表示细胞倍增时间，Nt表示第t天的细胞数目，No表示初始接种细胞数目，At表示从接种到计数时的天数。[0051][0052]以培养时间为X轴，细胞数目为Y轴绘制细胞生长曲线，见图4。通过计算获得HBE-TT细胞倍增时间为44.5±2.7h。[0053]实施例4特异分子表达检测[0054]角蛋白（cytokeratin是人支气管上皮细胞特异表达的分子标志物，为了对永生化细胞HBE-TT细胞进行验证，利用免疫荧光法检测人支气管上皮细胞特异分子角蛋白cytokeratin在永生化细胞HBE-TT中的表达情况。[0055]该实验以本课题组保存的永生化人支气管上皮细胞16HBE为阳性对照（也可以用市面上供应的16HBE细胞，另外也可以采用美国典型培养物保藏中心ATCC的人支气管上皮细胞商品货号:NL20ATCG®CRL2503™作为阳性对照），以HLF细胞为阴性对照。为检测是否有平滑肌污染，同时检测了肌动蛋白CiCt-SMA的表达情况，以HLF细胞作为阳性对照，16HBE细胞为阴性对照。[0056]具体步骤为:将细胞接种在24孔板50000孔），24小时后用I3BS洗涤2次，用3.7%甲醛室温固定15min;用PBS洗涤三次，用0.2%tritonX-100通透5min;用PBS洗涤三次，用3%胎牛血清37°C封闭SOmin13PBS洗3次，分别加α-SMA1:1000、cytokeratin1:1000—抗稀释液，4°C孵育过夜；PBS洗3次，加二抗稀释液（1:5000，37°C孵育1小时；PBS洗3次，加DAPI1:1000染色，5min后吸走染色液，用PBS洗1次，于倒置荧光显微镜下拍照。[0057]结果显示，与阳性对照细胞（16HBE—致，永生化的HBE-TT细胞特异性表达cytokeratin，而阴性对照细胞HLF则不表达该蛋白，见图5。并且通过检测α-SMA，发现其只在阳性细胞HLF中表达，而16HBE和HBE-TT细胞株中均未检测到其表达（图6。提示，HBE-TT细胞株未遭受平滑肌细胞污染。本实验结果证实HBE-TT细胞株保持了人支气管上皮细胞的典型特征，并且未出现文献中常见的平滑肌细胞污染。[0058]实施例5支原体污染检测[0059]实验方法:待HBE-TT细胞融合度达约90%时，收集细胞培养液，200g离心5min去除大部分真核细胞；13000g离心IOmin，取上清，等体积I3BS洗一次，IOOyLPBS重悬沉淀，95度加热15min裂解支原体。然后用标准酚一氯仿法抽提支原体DNA。以下列体系行PCR反应：[0060][0061]PCR反应条件为：95°C，7min;72°C，3min;95°C4s，65°C8s，72°C16s，32个循环；72°C，IOmin;18°C①。PCR反应结束后，取IOyLPCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。[0062]所用引物均由中山大学基础医学院医微生物学实验室馈赠，具体的，引物Myco-5’为如下引物的混合物：[0063]Mycoplasma-Fl:5,CGCCTGAGTAGTACGTTCGC3，[0064]Mycoplasma-F2:5,CGCCTGAGTAGTACGTACGC3，[0065]Mycoplasma-F3:5,TGCCTGGGTAGTACATTCGC3，[0066]Mycoplasma-F4:5,TGCCTGAGTAGTACATTCGC3，[0067]Mycoplasma-F5:5,CGCCTGAGTAGTATGCTCGC3，[0068]Mycoplasma-F6:5,CGCCTGGGTAGTACATTCGC3，[0069]引物Myco-3’为如下引物的混合物：[0070]Mycoplasma-Rl:5,GCGGTGTGTACAAGACCCGA3，[0071]Mycoplasma-R2:5,GCGGTGTGTACAAAACCCGA3，[0072]Mycoplasma-R3:5,GCGGTGTGTACAAACCCCGA3，[0073]同时还设有阳性对照和阴性对照，其中阳性对照进行PCR反应时其模板为支原体片段，阴性对照进行PCR反应时其模板为无菌去离子水。[0074]实验结果发现=HBE-TT培养基核酸提取物与阴性对照一样，没有支原体片段，而阳性对照反应产物有长度为520bp的支原体基因片段，结果见图7图中NC对应于阴性对照，PC对应于阳性对照），提示HBE-TT细胞未遭受支原体污染。[0075]实施例6裸鼠成瘤性[0076]为检测HBE-TT细胞株的恶性转化特征，开展了裸鼠皮下成瘤实验。[0077]实验方法：待HBE-TT细胞融合度达80%左右时，用0.25%胰酶消化细胞并计数，PBS洗涤3次。最后用I3BS重悬，使悬液中细胞浓度为IXIO7个mL。将4-5周龄的裸鼠随机分组，于裸鼠大腿背部进行皮下注射，每个待测细胞接种3个部位，每个部位接种200yL细胞悬液，皮下注射5天后开始观察肿瘤生长情况。本实验以肝癌细胞株SMMC为阳性对照。[0078]结果：皮下注射1周以后，阳性对照组裸鼠在注射部位均长出明显突出物，且随着实验的进行，突起物不断增大，5-6周长至约IXIcm图8中左图）。而注射HBE-TT细胞株的裸鼠12周仍无瘤体产生（图8中右图）。本发明的人支气管上皮细胞系HBE-TT未呈现恶性转化特征，可用于化学致癌机制研究和生物标志物筛查。[0079]实施例7对HBE-TT细胞株进行STR分析[0080]本实验交由中国典型培养物保藏中心武汉执行，主要技术流程为:提取细胞DNA后，采用Goldeneye™20ASTR复合扩增试剂盒进行扩增，在ABI3100遗传分析仪上连续对21个已知的STR位点和性别基因Amelogenin进行检测分析，以确定待检测细胞的特异性，并判断是否有其他细胞交叉污染。[0081]通过对21个已知的STR位点和性别基因Amelogenin进行检测分析，其结果见表1和图9，发现HBE-TT细胞株在各基因座均未出现三等位基因现象，细胞中没有发现人类细胞交叉污染。并且HBE-TT细胞STR数据与DSMZ、JCRB的STR数据库相对比，均未找到与其细胞分型100%匹配的细胞，与现有的其它体外细胞不同，为独一无二的细胞株。[0082]表I.HBE-TT细胞21个位点分析结果[0083][0084]由上述实验可知，经STR鉴定结果证实，本发明的人支气管细胞系HBE-TT无杂细胞污染，本发明的人支气管上皮细胞系HBE-TT区别于其它所有的体外细胞，为独一无二的细胞系。[0085]实施例8[0086]下面对本发明的HBE-TT细胞传代培养、冻存、以及复苏方法说明如下：[0087]8.1HBE-TT细胞传代培养[0088]将HBE-TT细胞接种于6cm培养皿，加入4.5mL人支气管上皮细胞培养基，于37°C培养箱5%⑶2中维持培养。待细胞融合度约90%时，吸掉旧培养基，用37°C预热的PBS洗一次，加200yL0.25%胰酶，37°C消化2min使贴壁细胞从皿底脱落。加入500yLDMED培养基10%FBS终止消化，并轻轻吹打成细胞悬液。将细胞悬液转移到15mL离心管，加入7mLPBS洗涤，750g离心5min，弃上清。加入ImL人支气管上皮细胞培养基将细胞轻轻吹散，以1:3接种到新的6cm皿，补充人支气管上皮细胞培养基至3.5mL。接种24h后补充ImL新鲜人支气管上皮细胞培养基，继续培养。[0089]8·2HBE-TT细胞冻存[0090]待HBE-TT细胞长至对数生长期，按照8.1中的方法进行消化、离心收集细胞，弃掉上清液，加入适量人支气管上皮细胞冻存液〜500，000-2，000，000个mL并将细胞轻轻吹散。将细胞悬液分装至冻存管，每皿细胞可冻2支。之后将冻存管放入冻存盒并放于-80°C冰箱。24h后将细胞转移到液氮罐保存。[0091]8.3HBE-TT细胞复苏[0092]从液氮罐取出细胞，立即用37°C水浴快速复苏。解冻后将细胞悬液转移到15mL离心管，加7mLPBS洗涤，750g离心5min，丢弃上清液。用0.5mL人支气管上皮细胞培养基将细胞沉淀轻轻吹散，转移到6cm培养皿，加入3mL人支气管上皮细胞培养基。放置培养箱常规培养。24小时后补ImL人支气管上皮细胞培养基继续培养，待细胞融合度达到约90%时可按照上述8.1的方法传代。[0093]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

权利要求：1.一种人支气管上皮细胞株，其特征在于，命名为人支气管上皮细胞株HBE-TT，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201560;所述人支气管上皮细胞株HBE-TT使用的质粒包括pBabe-hyg-hTERT和pBABE-neo-largeTcDNA;所述人支气管上皮细胞株的制备方法包括如下步骤：1原代支气管上皮细胞的获取和培养；2细胞永生化，包括接种并转染包装细胞、接种靶细胞、收集病毒上清液并感染靶细胞和阳性细胞筛选的步骤；所述接种并转染包装细胞的步骤如下：以lX106皿的密度接种293T细胞于10cm培养皿，24h后将pBABE-neo空载体、pBABE-neo-largeTcDNA、pBABE-hyg-hTERT和pCL-ampho四种质粒的浓度统一调整为lygyL，然后用FuGENE-6进行转染，按如下比例配制反应体系：pBABE-hyg-liTERT或pBABE-nco-largeTcDNA或pBABE-rux5pLpCL-Arnpho5μΙ,FuGENE-615μΙDMEM不含血清和抗生素73pL总计IOOpLe2.根据权利要求1所述的人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述人支气管上皮细胞株HBE-TT在镜下观察其形态呈多边形。3.根据权利要求1所述的人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述人支气管上皮细胞株HBE-TT的细胞倍增时间为44.5±2.7h。4.根据权利要求1所述的人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述人支气管上皮细胞株HBE-TT的蛋白表达特征为:LT蛋白阳性表达，角蛋白阳性表达，肌动蛋白阴性表达。5.根据权利要求1所述的人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述人支气管上皮细胞株HBE-TT未遭受杂细胞交叉污染。6.根据权利要求1所述的人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述人支气管上皮细胞株HBE-TT未遭受病原微生物污染。7.如权利要求1〜6任一项所述的人支气管上皮细胞株HBE-TT的子代细胞。

百度查询： 中山大学 一种人支气管上皮细胞株HBE-TT

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