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申请/专利权人：中国水稻研究所

摘要：本发明提供了检测水稻品种珍汕97的qHd1弱感温性等位基因的10个特异性PCR分子标记，分别为Fir44142、Fir44143、Fir44144、Fir44145、Fir44146、Fir44147、Fir44148、Fir44149、Fir44150和Fir44151的PCR引物。利用这10个标记对水稻苗期所提取的DNA进行鉴定，可以检测待测材料是否转入水稻品种珍汕97的qHd1弱感温性等位基因。该等位基因能够削弱高温对抽穗的促进作用，进而保持足够的营养生长及物质积累，这对于品种产量潜力的发挥至关重要。整个检测过程的操作简单且准确性高。

主权项：检测水稻品种珍汕97的qHd1弱感温性等位基因的特异性PCR分子标记，包括Fir44142、Fir44143、Fir44144、Fir44145、Fir44146、Fir44147、Fir44148、Fir44149、Fir44150和Fir44151，其中，Fir44142的上游引物序列为5'‑CTATGAGTAAATTACATCGAGCAG‑3'SEQ ID NO:1；Fir44142的下游引物序列为5'‑GTACACACCAAATCCCTA‑3'SEQ ID NO:2；Fir44143的上游引物序列为5'‑AGATATTTGCACTACCATTTGTCG‑3'SEQ ID NO:3；Fir44143的下游引物序列为5'‑CCGGTTAATCTAGTCAACTCT‑3'SEQ ID NO:4；Fir44144的上游引物序列为5'‑CATATGGGTCTCTACTACCAAG‑3'SEQ ID NO:5；Fir44144的下游引物序列为5'‑TAAAGTGCAACATGTCGAACC‑3'，SEQ ID NO:6；Fir44145的上游引物序列为5'‑GTCTTTAATACAATTTAGATGGGT‑3'SEQ ID NO:7；Fir44145的下游引物序列为5'‑CTCTATCGCCGCCTAAGGAG‑3'SEQ ID NO:8；Fir44146的上游引物序列为5'‑ATCGGCCAAACTAGGGAT‑3'SEQ ID NO:9；Fir44146的下游引物序列为5'‑ACCAACAGCGCAATACAC‑3SEQ ID NO:10；Fir44147的上游引物序列为5'‑CGAGGAGCACCTTAGTGTACG‑3'SEQ ID NO:11；Fir44147的下游引物序列为5'‑ACTGTTTGATCTAATTAGTCC‑3'SEQ ID NO:12；Fir44148的上游引物序列为5'‑AACCCGCTACCAAATTACCAC‑3'SEQ ID NO:13；Fir44148的下游引物序列为5'‑CCGTCATCGCCCGTTC‑3'SEQ ID NO:14；Fir44149的上游引物序列为5'‑TCCATACTGTGCTTTTAGCCAC‑3'SEQ ID NO:15；Fir44149的下游引物序列为5'‑GTTGAATTTTCCGATGAACATC‑3'SEQ ID NO:16；Fir44150的上游引物序列为5'‑TTTTCATTGGACAAATAAATGCTC‑3'SEQ ID NO:17；Fir44150的下游引物序列为5'‑AAAGGTCGATGACAATGA‑3'SEQ ID NO:18；Fir44151的上游引物序列为5'‑CAATTCATTATCATGGAAGTC‑3'SEQ ID NO:19；Fir44151的下游引物序列为5'‑TGAATTTATAGATTAAACATGCAC‑3'SEQ ID NO:20。

全文数据：检测水稻品种珍汕97的qHd1弱感温性等位基因的特异性PCR分子标记技术领域[0001]本发明属于水稻育种技术领域，涉及检测水稻品种珍汕97的qHdl弱感温性等位基因的特异性PCR分子标记。背景技术[0002]适宜的抽穗期是保证水稻品种在特定生态条件下对光温资源充分利用的必要前提，直接决定着生育前期的光合营养物质积累，对品种产量潜力的发挥至关重要。水稻从播种至抽穗可以划分为两个连续的阶段：即营养生长阶段播种至穗起始分化和生殖生长阶段穗起始分化至抽穗）。其中，生殖生长穗分化阶段基本稳定在30天左右，而营养生长阶段由于决定于品种的基本营养生长性、感光性以及感温性，变异十分广泛。水稻的营养生长阶段对环境条件特别敏感，尤其是对日照长度与温度的变化，但是，在特定生产区的特定生长季中，日照长度的变化是固定的，而温度波动则是随机的。在大田生产中，我们通常能观察到高温对抽穗的促进作用；并且，伴随着全球气候变暖，高温天气愈加频繁地出现，这就迫切要求育种家选育弱感温性的水稻品种，以保证足够的营养生长与物质积累，有效发挥品种的增产潜力，减轻高温的负效应。[0003]弱感温性水稻品种的培育一般通过应用弱感温的水稻材料、采用杂交选育获得。采用传统的选育方法，需要在后代中进行感温反应鉴定，费事费力，育种周期较长。随着分子标记的快速发展，借助分子标记辅助选择，可以在杂交选育过程中，在水稻生长发育的任一阶段检测弱感温性等位基因是否已导入目标受体品种，提高育种效率。[0004]分子标记辅助选择育种的开展需具备三个条件：[0005]⑴供体亲本携带效应明确、已精细定位或克隆的目标基因；[0006]2已开发出与目标基因紧密连锁且检测简便的标记；[0007]3连锁标记在供体和受体亲本之间呈多态性。[0008]前期研究中，我们在水稻第1染色体长臂末端克隆了一个控制水稻感温性的QTLqHdl，其弱感温性等位基因来源于水稻品种珍汕97。本发明在此基础上对qHdl区间进行测序，根据测序结果设计基因功能标记，用于特异性鉴定珍汕97的等位基因。本发明提供的分子标记对珍汕97的qHdl弱感温性等位基因的检测具有普遍应用价值，可以广泛地应用于该弱感温性等位基因的转育研究。发明内容[0009]本发明解决的技术问题是:传统选育方法需要在后代中进行感温反应鉴定，费事费力，育种周期较长，因此，本发明提供了10个鉴定水稻品种珍汕97的qHdl弱感温性等位基因的特异性分子标记，特异性好，操作简便，成本低，实用性高。[0010]本发明采用以下技术方案实现：[0011]本发明构建了以珍汕97为遗传背景、qHdl座位上分别呈珍汕97和密阳46纯合型的近等基因系，于浙江杭州开展了大田分期播种试验。近等基因系群体抽穗期鉴定结果显示，qHdl能响应环境温度的变化以调控水稻抽穗，具体表现为，该位点携带珍汕97等位基因的材料在高温条件下能够保持相对稳定的抽穗期，即具有相对稳定的营养生长见表1。[0012]表IqHdl的两种纯合型材料的抽穗期表现[0013][0014]通过目标区间测序分析与候选基因表达分析，鉴定L0C_0s01g69850http:rice.plantbiology.msu.edu为目标基因。相比于密阳46等位基因，珍汕97等位基因在该目标基因的第一内含子上存在一个9.5-kb的序列插入。于是，我们针对该序列结构变异，设计了10个与qHdl紧密连锁的基因标记。这些标记的扩增产物均约1.3-kb，并呈连续交叠排列，覆盖整个序列变异，交叠区间约300-bp。如果能扩增出目标长度的产物，则表明被检测材料携带珍汕97的qHdl弱感温性等位基因，反之亦然。[0015]本发明检测水稻品种珍汕97的qHdl弱感温性等位基因的特异性PCR分子标记，包括Fir44142、Fir44143、Fir44144、Fir44145、Fir44146、Fir44147、Fir44148、Fir44149、Fir44150和Fir44151，其中，[0016]Fir44142的上游引物序列为5’-CTATGAGTAAATTACATCGAGCAG-3’（SEQIDN0:1;Fir44142的下游引物序列为5’-GTACACACCAAATCCCTA-3’（SEQIDN0:2;[0017]Fir44143的上游引物序列为5’-AGATATTTGCACTACCATTTGTCG-3’（SEQIDN0:3;Fir44143的下游引物序列为5’-CCGGTTAATCTAGTCAACTCT-3’（SEQIDN0:4;[0018]Fir44144的上游引物序列为5’-CATATGGGTCTCTACTACCAAG-3’（SEQIDN0:5;Fir44144的下游引物序列为5’-TAAAGTGCAACATGTCGAACC-3’，（SEQIDN0:6;[0019]Fir44145的上游引物序列为5’-GTCTTTAATACAATTTAGATGGGT-3’（SEQIDN0:7;Fir44145的下游引物序列为5’-CTCTATCGCCGCCTAAGGAG-3’（SEQIDN0:8;[0020]Fir44146的上游引物序列为5’-ATCGGCCAAACTAGGGAT-3’（SEQIDN0:9;Fir44146的下游引物序列为5’-ACCAACAGCGCAATACAC-3SEQIDN0:10;[0021]Fir44147的上游引物序列为5’-CGAGGAGCACCTTAGTGTACG-3’（SEQIDNO:11;Fir44147的下游引物序列为5’-ACTGTTTGATCTAATTAGTCC-3’（SEQIDN0:12;[0022]Fir44148的上游引物序列为5’-AACCCGCTACCAAATTACCAC-3’（SEQIDNO:13;Fir44148的下游引物序列为5’-CCGTCATCGCCCGTTC-3’（SEQIDN0:14;[0023]Fir44149的上游引物序列为5’-TCCATACTGTGCTTTTAGCCAC-3’（SEQIDN0:15;Fir44149的下游引物序列为5’-GTTGAATTTTCCGATGAACATC-3’（SEQIDN0:16;[0024]Fir44150的上游引物序列为5’-TTTTCATTGGACAAATAAATGCTC-3’（SEQIDN0:17;Fir44150的下游引物序列为5’-AAAGGTCGATGACAATGA-3’（SEQIDN0:18;[0025]Fir44151的上游引物序列为5’-CAATTCATTATCATGGAAGTC-3’（SEQIDNO:19;Fir44151的下游引物序列为5’-TGAATTTATAGATTAAACATGCAC-3’（SEQIDN0:20。[0026]以上标记的PCR扩增均采用如下体系：Tris-HCLpH8.833.5mM，（NH42SO48.0mM，MgCl21.5mM，TWEEN-200.05%，dNTPs0.2mM，上、下游引物各3.3ngAU，TaqDNA聚合酶2.0单位，模版DNA50ng。PCR反应条件均一致，具体参数为:94°C2分钟;94°C45秒、55°C45秒、72°C2分钟，35个循环;72°C5分钟。[0027]本发明的优点在于:这10对分子标记均以基因内部的序列结构变异为基础设计，与基因完全连锁，准确性高，可用于qHdl弱感温性等位基因的检测，分子标记辅助选择及转育，基因型分析等用途。检测方法特异性好，操作简便，成本低，实用性高。附图说明[0028]图1是qHdl在珍汕97和密阳46基因组序列上的关键差异示意图，即目标基因L0C_0s01g69850第一内含子上约9.5_kb的序列结构变异。[0029]图2是标记Fir44142、Fir44151以及由Fir44142的上游引物与Fir44151的下游引物组成的引物对，针对qHdl分离群体的前20份材料的检测结果图。其中，M:分子量标记;ZS:珍汕97;MY:密阳46;2、3、4、7、9、10、12、13、14、16和19为鉴定出的11个呈珍汕97纯合型的株系；1、5、6、8、11、15、17、18和20为鉴定出的9个呈密阳46纯合型的单株。[0030]图3是分期播种试验中日照长度和日平均温度的情况示意图。I，II，III，IV，V分别对应5个不同的播种期;各横条表示各个播期试验从播种至抽穗的持续时间以及相应的日平均温度。[0031]图4是五个播期处理条件下qHdl的两种纯合型材料的抽穗感温反应示意图。随着播期延迟，环境温度升高，密阳46纯合型株系株系编号1、5、6、8、11、15、17、18和20的抽穗期以约5天的速度逐步提前;珍汕97纯合型株系（株系编号2、3、4、7、9、10、12、13、14、16和19在前3个播期中表现出相近的抽穗增速，而在此之后，抽穗期保持稳定。具体实施方式[0032]以下结合实施例来进一步解释本发明，下述实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。[0033]实施例[0034]1、供试材料[0035]以珍汕97为轮回亲本、密阳46为供体亲本，经多代回交和自交，结合标记检测筛选，构建了在qHdl区间分离的BC2F14近等基因系群体。其中，qHdl呈珍汕97纯合型和密阳46纯合型的株系各50个。在该位点上，相比于密阳46等位基因，珍汕97等位基因在第一内含子中存在一段约9.5-kb的插入图1[0036]2、水稻基因组DNA提取与基因型检测[0037]IDNA提取:将珍汕97、密阳46及各近等基因系的种子分别置于预先标号的培养皿，30°C发芽7天，采用简易法从幼苗叶片中提取DNA。[0038]2PCR扩增:PCR扩增均采用20μ1反应体系：Tris-HCLpH8.833.5mM，（NH42S〇48.0mM，MgCl21.5mM，TWEEN-200.05%，dNTPs0.2mM，上、下游引物各3.3ngAU，TaqDNA聚合酶2.0单位，模版DNA50ng。[0039]PCR反应条件均一致，具体参数为:94°C2分钟;94°C45秒、55°C45秒、72°C2分钟，35个循环;72°C5分钟。[0040]3PCR产物电泳及显色:扩增产物中加入加样缓冲液，每样品取6μ1上样于1%琼脂糖凝胶；接通电极，在100V恒定电压下电泳30分钟，关闭电源；取下凝胶，GelRed染色显色。[0041]如图2所示:所设计的标记能从qHdl的分离群体中鉴定出携带不同等位基因的株系。其中，携带珍汕97等位基因的株系均能应用上述10个特异性标记扩增出约1.3-kb的片段（图2仅以其中第一个和最后一个标记Fir44142和Fir44151为例），但是不能应用由Fir44142的上游引物与Fir44151的下游引物组成的引物对扩增出约Ι.Ο-kb的片段;相反，携带密阳46等位基因的株系却能用由Fir44142的上游引物与Fir44151的下游引物组成的引物对扩增出约Ι.Ο-kb的片段，但是不能用上述10个特异性标记扩增出相应片段。图2仅列出参试近等基因系群体的前20个株系的基因型鉴定结果:株系编号2、3、4、7、9、10、12、13、14、16和19的是珍汕97纯合型，共11个;而株系编号1、5、6、8、11、15、17、18和20的是密阳46纯合型，共9个。[0042]3、特异性PCR标记对珍汕97的qHdl弱感温性等位基因的鉴定效果评价[0043]qHdl近等基因系群体于2015年4月至11月间在浙江省杭州市富阳区的中国水稻研究所试验基地进行田间分期播种试验。共设五个播期处理，即第I期:4月28日播种5月25日移栽;第Π期:5月8日播种6月2日移栽;第ΙΠ期:5月20日6月11日移栽;第IV期:6月15日播种7月6日移栽;第V期：7月9日播种7月29日移栽。通过收集当地该生产季的光温资源数据，以日平均温度以及日照时长表示（图3，可以发现，所有参试株系的感光期均处在长日条件下，环境温度则随播期延迟而逐渐升高。该群体采用随机区组设计，每个株系两重复，每个重复12个单株，按单株记载抽穗期，以同一个重复株系内的均值作为基础进行数据分析。[0044]图2与图4结果显示，基因型鉴定结果和感温性反应检测结果完全一致（图中仅列出前20个株系的结果）。随着播种期的延迟，密阳46纯合型株系的抽穗期以平均5天的速度逐步缩短;珍汕97纯合型株系的抽穗期在前3个播期试验中以相近的速度缩短，但从第3期起，其抽穗期则保持相对稳定，约68天。qHdl的两种纯合基因型材料在各播期试验中的抽穗期，以及基因型间抽穗期差异的方差分析结果见表1。[0045]以上结果表明，本发明提供的分子标记可有效地检测材料在qHdl位点上是否携带珍汕97的弱感温性等位基因。

权利要求：1.检测水稻品种珍汕97的qHdl弱感温性等位基因的特异性PCR分子标记，包括Fir44142、Fir44143、Fir44144、Fir44145、Fir44146、Fir44147、Fir44148、Fir44149、Fir44150和Fir44151，其中，Fir44142的上游引物序列为5’-CTATGAGTAAATTACATCGAGCAG-3’（SEQIDN0:1;Fir44142的下游引物序列为5’-GTACACACCAAATCCCTA-3’（SEQIDN0:2;Fir44143的上游引物序列为5’-AGATATTTGCACTACCATTTGTCG-3’（SEQIDN0:3;Fir44143的下游引物序列为5’-CCGGTTAATCTAGTCAACTCT-3’（SEQIDN0:4;Fir44144的上游引物序列为5’-CATATGGGTCTCTACTACCAAG-3’（SEQIDN0:5;Fir44144的下游引物序列为5’-TAAAGTGCAACATGTCGAACC-3’，（SEQIDN0:6;Fir44145的上游引物序列为5’-GTCTTTAATACAATTTAGATGGGT-3’（SEQIDN0:7;Fir44145的下游引物序列为5’-CTCTATCGCCGCCTAAGGAG-3’（SEQIDN0:8;Fir44146的上游引物序列为5’-ATCGGCCAAACTAGGGAT-3’（SEQIDN0:9;Fir44146的下游引物序列为5’-ACCAACAGCGCAATACAC-3SEQIDN0:10;Fir44147的上游引物序列为5’-CGAGGAGCACCTTAGTGTACG-3’（SEQIDN0:11;Fir44147的下游引物序列为5’-ACTGTTTGATCTAATTAGTCC-3’（SEQIDN0:12;Fir44148的上游引物序列为5’-AACCCGCTACCAAATTACCAC-3’（SEQIDN0:13;Fir44148的下游引物序列为5’-CCGTCATCGCCCGTTC-3’（SEQIDN0:14;Fir44149的上游引物序列为5’-TCCATACTGTGCTTTTAGCCAC-3’（SEQIDN0:15;Fir44149的下游引物序列为5’-GTTGAATTTTCCGATGAACATC-3’（SEQIDN0:16;Fir44150的上游引物序列为5’-TTTTCATTGGACAAATAAATGCTC-3’（SEQIDN0:17;Fir44150的下游引物序列为5’-AAAGGTCGATGACAATGA-3’（SEQIDN0:18;Fir44151的上游引物序列为5’-CAATTCATTATCATGGAAGTC-3’（SEQIDN0:19;Fir44151的下游引物序列为5’-TGAATTTATAGATTAAACATGCAC-3’（SEQIDN0:20。

百度查询： 中国水稻研究所 检测水稻品种珍汕97 的qHd1弱感温性等位基因的特异性PCR分子标记