申请/专利权人：中国农业科学院作物科学研究所

申请日：2015-03-27

公开（公告）日：2015-07-22

公开（公告）号：CN104789574A

主分类号：C12N15/29(2006.01)I

分类号：C12N15/29(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;A01H5/00(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2018.06.08#授权;2015.08.19#实质审查的生效;2015.07.22#公开

摘要：本发明提供了小麦TaSPL6基因及其应用，属于作物分子生物学领域。本发明设计特异性引物从中国春小麦叶的cDNA中克隆TaSPL6的编码区序列，利用缺体四体将TaSPL6定位在小麦第五同源群上，TaSPL6基因编码区序列在A、B、D同源染色体中的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。本发明通过将TaSPL6基因转化拟南芥，发现该基因能够使拟南芥叶片增大、生物量增加。

主权项：小麦TaSPL6基因在小麦育种中的应用，其特征在于，小麦TaSPL6基因位于小麦第五同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQ ID NO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQ ID NO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQ ID NO.3所示。

全文数据：小麦TaSPL6基因及其应用技术领域[0001]本发明涉及作物分子生物学和分子育种领域，更具体地，涉及小麦TaSPL6基因及其在染色体中的定位、以及该基因的应用。背景技术[0002]小麦作为一种重要的粮食作物，全世界有35%_40%的以小麦为主要粮食。同时作为三大谷物之一，产量几乎全做食用，是世界上总产量仅次于玉米的粮食作物。随着水稻、玉米等在内的多种植物全基因组测序的完成，人类开始进入功能基因的时代。利用物种已知功能的目标基因进行序列比对和分析，利用高保守序列对研究物种进行引物设计和同源序列克隆，是发现新基因的常用方法之一。[0003]SPLsquamosapromoterbindingprotein-like是一类植物特有的转录因子，在调控植物生长和生殖阶段转变、花和果实发育、光信号转导及植株形态建成等多种发育过程中发挥重要作用。SPL含有一个由80个氨基酸残基组成的高度保守的SBP结构域，以此同下游靶基因启动子区域结合，调控靶基因的表达。目前，在水稻中，对SPL基因有了比较详尽的认识。小麦作为人类重要的粮食作物，但是关于SPL基因家族在小麦中结构和功能分析还是知之甚少，对该基因在小麦的生物功能和分子基础尚不清楚。发明内容[0004]本发明的目的在于提供小麦TaSPL6基因及其应用。[0005]利用水稻SPL基因保守的SBP结构域和小麦二倍体AA、DD基因草图测序结果，先在二倍体中克隆SPL基因，利用二倍体与六倍体的同源性，然后以普通小麦中国春叶片cDNA为模板利用PCR方法扩增得到在A、B、D同源染色体上的基因序列，分别如SEQIDNO.1-3所示，该基因命名为TaSPL6。该基因定位于第五染色体同源群上。[0006]本发明提供了小麦TaSPL6基因在小麦分子育种中的应用。[0007]本发明提供了小麦TaSPL6基因在促进植物生长中的应用。[0008]本发明提供了小麦TaSPL6基因在制备转基因植物中的应用。[0009]本发明提供了小麦TaSPL6基因在小麦种质资源改良中的应用。[0010]本发明提供了小麦TaSPL6基因在促进拟南芥生物量增加中的应用。[0011]具体地，本发明所述的小麦TaSPL6基因位于小麦第五同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQIDNO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQIDNO.2所示，其在小麦同源染色体的序列如SEQIDNO.3所示。[0012]本发明提供了用于克隆小麦TaSPL6基因的引物组合，其核苷酸序列如SEQIDNO.4-5所示。[0013]本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒。[0014]进一步地，本发明提供了上述试剂盒在小麦遗传育种中的应用。[0015]进一步地，本发明提供了上述试剂盒在制备转基因植物中的应用。[0016]相应地，本发明提供了小麦TaSPL6基因的克隆方法，利用SEQIDNO.4-5所示的特异性引物组合，以小麦叶cDNA为模板，PCR扩增得到小麦TaSPL6基因。[0017]进一步，本发明还提供了检测小麦TaSPL6基因的SNP分子标记，检测小麦TaSPL6A基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：[0018]SPL6A-F-primerTTGCTCTAGGGTTTCGTC[0019]SPL6A-R-primerTACACCTAACCTTATTTCG；[0020]检测小麦TaSPL6B基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：[0021]SPL6B-F-primerCGGGAATTCGATTGTGCTT[0022]SPL6B-R-primerTCCTAACCTTATTTCGACCC；[0023]检测小麦TaSPL6D基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：[0024]SPL6D-F-primerGACATGGAGGCGGCCAG[0025]SPL6D-R-primerCGGACCCCTCACATGGCTC〇[0026]含有上述SNP分子标记的试剂盒也属于本申请的保护范围。[0027]本发明提供了上述SNP分子标记或含有其的试剂盒在检测小麦TaSPL6基因中的应用。[0028]本发明提供了上述SNP分子标记或含有其的试剂盒在小麦分子标记辅助育种中的应用。[0029]进一步地，利用上述检测小麦TaSPL6基因的SNP分子标记的引物对扩增待测样品，若得到的目的条带为2.8kb，则意味着待测样品中存在TaSPL6基因。[0030]本发明提供了小麦TaSPL6A基因或TaSPL6B基因或TaSPL6D基因在促进植物生长中的应用。[0031]具体地，本发明提供了小麦TaSPL6基因在促进植物早花或叶片增大或增加植物生物量中的应用。更具体地，本发明提供了小麦TaSPL6基因在促进转基因拟南芥叶片增大，生物量增加，植株的鲜重增加中的应用。[0032]本发明提供了小麦TaSPL6基因的染色体定位以及该基因在促进植物早花或叶片增大或增加植物生物量中的生物学功能，本发明的小麦TaSPL6基因可广泛应用于小麦遗传育种、种质资源改良和培育转TaSPL6基因的植物领域，对改进和改良小麦等作物的种质资源具有重要作用。附图说明[0033]图1为TaSPL6基因在小麦染色体中定位图，1-7分别表示阳六-了58，阳六150，阳8-T5A，N5B-T5D，N5D-T5A，N5D-T5B，CS是中国春对照。[0034]图2为TaSPL6A基因的转录激活图。PBD是指载体里有可以与其他基因结合的结构域，PBD-TaSPL6B指将TaSPL6B基因的编码序列与带有结合结构域的载体相连接），1为-Trp，即缺色氨酸的SD固体缺素培养基，2为-Trp_His，即缺色氨酸和组氨酸的SD固体缺素培养基、3为-Trp-His-Ade，即缺色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的SD固体缺素培养基。[0035]图3为拟南芥野生型、转TaSPL6B基因的拟南芥植株在20d、30d的生长情况图，1表示拟南芥野生型Col-O，2表示TaSPL6B过表达拟南芥植株。[0036]图4为拟南芥野生型Col-O、过表达TaSPL6B基因的拟南芥的植株鲜重比较图，从左到右分别为LI-L4表示4个不同的重复组。具体实施方式[0037]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。[0038]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0039]实施例1小麦TaSPL6基因的克隆[0040]1、小麦叶片总RNA的提取[0041]中国春小麦TriticumaestivumL.叶片总RNA的提取，使用PlantRNeasyKitQiagen〇[0042]2、TaSPL6基因cDNA第一片段的合成[0043]按照反转录酶M-MLVTaKaRa的操作说明进行。[0044]3、从中国春小麦TriticumaestivumL.叶的cDNA中克隆TaSPL6的编码区序列；正向、反向引物序列如SEQIDNO.4-5所示。[0045]PCR程序：94°C，5min;94°C，30s;56°C，30s;72°C，3min;重复35次；72°C，10分钟。[0046]PCR体系：[0048]PCR产物切胶回收纯化后按照北京全式金生物技术有限公司提供的pEASY-TlSimpleCloningKit克隆方法克隆连接到pEASY-TlSimple载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得TaSPL6。对获得的3条片段送测序公司测序后，与二倍体克隆的SPL6比较，确定TaSPL6基因在A、B、D同源染色体序列分别如SEQIDNO.1-3所示。[0049]实施例2小麦TaSPL6基因的染色体定位[0050]根据实施例1获得的TaSPL6基因在A、B、D同源染色体序列，经过对比分析，发现三者核苷酸序列存在多态性。设计3对特异性引物，以中国春缺体四体的DNA为模板，进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳定位TaSPL6基因在染色体中的位置。[0051]所述3对特异性引物为：[0052]检测小麦TaSPL6A基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：[0053]SPL6A-F-primerTTGCTCTAGGGTTTCGTC[0054]SPL6A-R-primerTACACCTAACCTTATTTCG；[0055]检测小麦TaSPL6B基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：[0056]SPL6B-F-primerCGGGAATTCGATTGTGCTT[0057]SPL6B-R-primerTCCTAACCTTATTTCGACCC；[0058]检测小麦TaSPL6D基因的SNP分子标记通过以下引物扩增得到：[0059]SPL6D-F-primerGACATGGAGGCGGCCAG[0060]SPL6D-R-primerCGGACCCCTCACATGGCTC〇[0061]利用上述检测小麦TaSPL6基因的SNP分子标记的3个引物对中任一对引物PCR扩增小麦基因组DNA，均可扩增得到2.8kb的目的条带。在检测时，若待测产物经上述引物对PCR扩增后，得到的目的条带为2.8kb，则意味着待测样品中存在TaSPL6基因。[0062]六倍体小麦基因型AABBDD有缺四体材料，是利用染色体替换形成的，N5A-T5B是指缺5A补5B，相当于用5B染色体代替5A染色体（基因型为BBBBDD，同理N5A-T5D基因型DDBBDD，N5B-T5A基因型AAAADD，N5B-T5D基因型AADDDD，N5D-T5A基因型AABBAA，N5D-T5B基因型AABBBB，TaSPL6A在N5A-T5B和N5A-T5D中扩不出来，在其他缺四体材料中可以扩出来，TaSPL6B和TaSPL6D同理。[0063]实施例3小麦TaSPL6基因在酵母中的转录激活实验[0064]1、酵母AH109感受态制备最好现用现配）[0065]酵母AH109在YPDA固体培养基上划线，然后挑取单克隆在ImlYPDA混匀，再转移至50mlYPDA中，30°C，220rpm摇菌16〜18h，至OD6XM·5。取30ml摇的菌至300mlYPDA中，检测OD6QQ，调节OD6QQ在0.2-0.3之间。然后在30°C，200rpm摇菌3h，至OD6QQ在0.4-0.6之间（若OD600〈0.4,即有错误）。将菌液倒入两个50ml离心管中，室温IOOOg离心5min。弃上清，用30mlddH2O彻底重悬沉淀物终体积25-50ml。室温IOOOg离心5min，弃上清。用Iml无菌IXTE1XLiAc溶液重悬菌体，分装1.5ml离心管，每管ΙΟΟμΙ置于-80°C保存备用。[0066]2酵母转化[0067]取ΙΟΟμΙ酵母感受态在冰上，加入5μ1载体质粒（pEASY-TlSimple载体与基因TaSPL6B连接后阳性克隆的质粒，大概Iyg和5μ1pBD载体未连接TaSPL6B的用于作对照），轻弹混勾。加入600μl无菌的lXPEGLiAc溶液，轻弹混勾10s。30°C，200rpm摇菌30min。加入70μ1DMS0,轻轻的温和颠倒混匀（不能涡旋）。42°：水浴热激15min，然后立即在冰上放置2min。室温IOOOOrpm离心15s，弃上清。用ImlYF1D重悬菌体，然后30°C，200rpm摇菌90min。室温HOOOrpm离心5s，弃上清。用Iml0.9%NaCl重悬菌体，取200μ1倒入SD固体缺素培养基【-Trp缺色氨酸），-Trp-His缺色氨酸和组氨酸）、-Trp-His-Ade缺色氨酸、组氨酸和腺嘌呤】中30°C倒置培养筛选，结果说明TaSPL6B具有转录因子的转录激活作用。[0068]实施例4小麦TaSPL6转化拟南芥[0069]渗透液（200ml:MS0.44g,蔗糖1^，10!1调？!1至6.0，120°：灭菌2〇11^11。[0070]拟南芥转化，取保存的含有过量表达载体PCAM2300载体与TaSPL6B的连接）的农杆菌于含有卡那霉素的LB培养基上划线，挑单克隆于液体培养基普通LB液体培养基含浓度50ugmL的卡那霉素）中培养3至4个小时后。利用PCR检测阳性克隆利用SPL6B-0E-F序列为ATGGAGGCGGCCAGGGTGGG和pCAM2300载体上的一段序列GAAACCGGCGGTAAGGAT作为检测引物），阳性克隆菌株移至普通LB液体培养基中，培养至菌液0D600达到1.5以上。转移至离心管中，6000rpm，室温离心5min，弃上清，用渗透液清晰沉淀表面后悬浮，最终悬浮液的0D600应在1.5左右，加0.05%的silwetl77。采用浸花法转化拟南芥。侵染完毕后用保鲜袋套住植株，黑暗放置24小时，然后取出，置于正常生长条件下培养。[0071]拟南芥转化实验，结果见图3、4，显示TaSPL6能使拟南芥叶片增大、生物量增加。[0072]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.小麦TaSPL6基因在小麦育种中的应用，其特征在于，小麦TaSPL6基因位于小麦第五同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQIDNO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQIDNO.2所示，其在小麦同源染色体的序列如SEQIDNO.3所示；所述的应用包括培育叶片增大或生物量增加的小麦。2.小麦TaSPL6基因在促进植物叶片增大中的应用，其特征在于，小麦TaSPL6基因位于小麦第五同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQIDNO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQIDNO.2所示，其在小麦同源染色体的序列如SEQIDNO.3所示。3.小麦TaSPL6基因在促进植物生物量增加及植株鲜重增加中的应用，其特征在于，小麦TaSPL6基因位于小麦第五同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQIDNO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQIDNO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQIDNO.3所示。4.小麦TaSPL6基因在制备植株鲜重增加的转基因植物中的应用，其特征在于，小麦TaSPL6基因位于小麦第五同源群上，其在小麦5A同源染色体的序列如SEQIDNO.1所示，其在小麦5B同源染色体的序列如SEQIDNO.2所示，其在小麦5D同源染色体的序列如SEQIDNO.3所示。5.用于克隆小麦TaSPL6基因的引物组合在小麦遗传育种中的应用，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4-5所示;所述的应用包括培育叶片增大或生物量增加的小麦。

百度查询： 中国农业科学院作物科学研究所 小麦TaSPL6基因及其应用

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