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申请/专利权人：河南牧业经济学院

摘要：本发明公开了一种用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的制备及其应用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题，其技术方案是：设计并合成引物和探针，用TE Buffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预设程序在醛基化基片上喷点式点样，制备用于检测猪伪狂犬病的基因芯片，其使用方法是，提取待测猪伪狂犬病病毒基因组DNA，采用不对称PCR制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果，本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需半小时，大大节省了时间，采用1μmL的探针浓度就可以达到信号强度，检测成本低，可用于大规模检测。

主权项：一种用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1设计引物和探针：以伪狂犬病的gE基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’‑cttccactcgcagctcttct‑3’，下游引物：5’‑gtagatgcagggctcgtacac‑3’，探针：5’NH2‑TTTTTTTTTT‑ttactgccacgctggactggtactacg‑3’；下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上10个T；2按常规方法对引物和探针进行合成；3基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上喷点式点样，点样完毕后将芯片静置于80℃烘箱干燥固定2小时。

全文数据：一种用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备及其应用方法技术领域[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体是一种用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备及其应用方法。背景技术[0002]现有的猪伪狂犬病的检测方法有血清学方法以及分子生物学方法等。血清学方法包括中和试验、酶联免疫吸附试验®LISA、乳胶凝集试验、血凝试验与血凝抑制试验，胶体金免疫层析，其中中和试验应用较为广泛。分子生物学方法灵敏度高、特异性好分子生物学方法灵敏度高、特异性好，该方法主要包括核酸探针、基因芯片、PCR检测等。多重PCR和套式PCR的应用提高了检测疾病的特异性和敏感性，可以用于大批样品的检查和流行病学调查；[0003]而基因芯片作为检测手段，其灵敏度可以达到pg级，是目前灵敏度最高的检测方法，并且精确性及信息量高，被应用于多种微生物的检测中。现已建立有针对猪繁殖障碍性疾病基因芯片的检测方法，但其试验操作步骤较为复杂而繁琐，需要对己点样的芯片进行水化和预杂交处理，且所需杂交探针的浓度较高，检测成本高。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题的用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备及其应用方法，以解决上述背景技术中提出的问题。[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：[0006]—种用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：[0007]⑴设计引物和探针：以伪狂犬病的gE基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’-cttccactcgcagctcttct-3,，下游引物：5,-gtagatgcagggctcgtacac-3,，探针：5’NH2-TTTTTTTTTT-ttactgccacgctggactggtactacg-3’；下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上1〇个T;[000S]⑵按常规方法对引物和探针进行合成；[0009]3基因芯片的制备：用TEBuffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上喷点式点样，点样完毕后将芯片静置于8〇t烘箱干燥固定2小时。[0010]作为本发明进一步的方案:所述的特异性引物的浓度为10uML。[0011]作为本发明进一步的方案:所述探针的浓度为l-30yML。[0012]作为本发明进一步的方案:所述喷点式点样的环境参数为相对湿度55_65%，温度l5_3〇°C，各探针点间距为1•5mm，点样阵列根据实验要求设定。[0013]—种用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的应用方法，包括以下步骤：[00M]1提取待测猪伪狂病病毒的基因组DNA;_5]⑵杂交用PCR产物的制备:采用不对称PC財广增，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混勾后置于PCR仪进行扩增，反应总体系为25此，其中10XPCR缓冲液2•5此，2•5mmolLdNTP3•OyL，10_L的荧光标记下游引物4•OnL，10umL的上游引物1.0iiL，DNA模板2•0i^L，ExTaqTM酶0•25i^L，灭菌水12•25uL，PCR扩增反应条件:94°C变性5min，94°C变性lmin，6TC变性30s，72°C变性lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin;[0016]3杂交用PCR产物与基因芯片杂交:将杂交用PCR扩增产物置于PCR仪上98。：变性lOmin后，立即取出冰浴l〇min，全程避光;取PCR扩增产物4〇yL和杂交缓冲液160uL加于离心管中，混匀后将该混合液加至芯片的点样区，将芯片放入杂交盒内，置于471杂交箱中避光杂交lh;[0017]⑷基因芯片的洗涤与干燥:基因芯片的洗涤应在暗室中完成，杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用第一洗液、第二洗液、第三洗液以及第四洗液各浸泡2min，上下抽提20次洗涤后离心干燥；[0018]5基因芯片的结果分析:将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值，基因芯片杂交结果判定的依据如下:模板DNA的PCR扩增效果良好;信号强度中位值1000,结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰;样点信号阈值SNR多1.5,杂交信号良好。[0019]作为本发明进一步的方案:所述杂交芯片洗涤所用第一洗液为1%柠檬酸钠缓冲液和0.2%SDS;第二洗液为0•1%柠檬酸钠缓冲液和0.2%SDS;第三洗液为〇.1%柠檬酸钠缓冲液。[0020]作为本发明再进一步的方案:所述样点信号阈值SNR是信号强度中位值与噪音中位值之比。[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0022]本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需lh，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用lMiL的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。附图说明[0023]图1为猪伪狂犬病基因芯片点样示意图。具体实施方式[0024]下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。[0025]请参阅图1，本发明设计并合成引物和探针，用TEBuffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按照预设程序在醛基化基片公知市售产品）上喷点式点样，制备用于检测猪伪狂犬病的基因芯片。[0026]本发明还提供了用于检测猪伪狂病的基因芯片的使用方法，包括以下步骤:提取待测猪伪狂病病毒的基因组DNA，采用不对称PCR制备杂交用PCR产物，与制备好的基因芯片杂交，经洗涤与干燥后，将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析结果。[0027]—种用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1设计引物与探针：根据GeneBank中登录的PRVgE基因序列（GeneBank序列号为AY170318为靶序列，设计特异性引物与探针，上游引物:5’-cttccactcgcagctcttct-3’，下游引物：5’-gtagatgcagggctcgtacac-3’、探针：5’NH2-TTTTTTTTTT-ttactgccacgctggactggtactacg-3’。下游引物5,端用Cy3进行焚光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上1〇个T;[0028]⑵对引物和探针进行合成:将步骤⑴所设计的引物和探针，交公司进行合成这是公知的合成途径）；[0029]3基因芯片的制备：用TEBuffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预设程序在醛基化基片公知市售产品）上喷点式点样，点样完毕后将芯片静置于8〇°C烘箱干燥固定2h。[0030]一种用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取待测猪伪狂犬病的基因组DNA;[0031]2杂交用PCR产物的制备:采用不对称PCR扩增，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，反应总体系为25uL，其中10XPCR缓冲液2•5此，2.5mmo1LdNTP3•OuL，10wnL的荧光标记下游引物4.OnL，1OwnL的上游引物1•OuL，DNA模板2•OuL，ExTaqTM酶0.25uL，灭菌水12.25uL。PCR扩增反应条件:94°C变性5min，94°C变性lmin，60°C变性30s，72°C变性lmin，共30个循环，最后72°C延伸10min。[0032]⑶杂交用PCR产物与权利要求1所述的基因芯片杂交:将杂交用pCR扩增产物置于PCR仪上98°C变性10min后，立即取出冰浴l〇min，全程避光。取PCR扩增产物40uL和杂交缓冲液l6〇uL加于离心管中，混匀后将该混合液加至芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将芯片放入杂交盒内，置于47°C杂交箱中避光杂交lh;[0033]⑷基因芯片的洗涤与干燥:基因芯片的洗涤应在暗室中完成，杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用第一洗液、第二洗液、第三洗液以及第四洗液各浸泡2min，上下抽提20次洗涤后离心千燥；[0034]5基因芯片的结果分析:将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。[0035]所述的引物浓度为lOwnL。[0036]所述探针浓度为1-30miL。[0037]点样环境参数为相对湿度55-65%，温度15-30°c，各探针点间距为i.5mm，占样阵列根据实验要求设定。^[0038]所述的杂交芯片洗涤所用第一洗液为1%柠檬酸钠缓冲液+0.2%SDS;第二洗液为〇•1%柠檬酸钠缓冲液+0•2%SDS;第三洗液为0•1%柠檬酸钠缓冲液;第四洗液为高压灭菌后的超纯水。[0039]所述的基因芯片杂交结果判定的依据如下：[0M0]⑴模板DNA的PCR扩增效果良好；[0041]2信号强度中位值多1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰；[0042]⑶检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念3顺，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1•5时，表明杂交信号良好，即^丨5。[0043]经试验证明，此方法灵敏可靠。应用效果好，有关资料如下：’•°[0044]1材料与方法：[0045]1.1材料：[0046]1.1.1毒株及病料来源：[0047]PRV阳性病料由河南农业大学惠赠。[0048]1.1.2芯片材料：[0049]基因芯片基片采用醛基化载玻片，购自上海百傲生物科技有限公司。[0050]1.1.3试验仪器：[0051]基因芯片点样仪，购自美国Bio-Dot公司；[0052]MILIP0RE-21J0纯水机，购自美国MILIP0RE公司；[0053]YEAR2000PCR仪，购自英国WhatmanBiometra公司；[0054]DBT-07凝胶成像系统，购自英国UVITEC公司；[0055]MLTRAPR080型超高速冷冻离心机，购自德国HermLer公司；[0056]TGL-16C台式高速低温离心机，购自德国Eppendorf公司；[0057]基因芯片扫描仪，购自法国Innopsys公司；[0058]-80°C超低温冰柜，购自Thermo公司；[0059]UVI紫外凝胶成像系统，购自UVItecSTJohn,sinnovationcentre;[0060]YJ-875净化工作台，购自苏州净化设备公司；[0061]SHA-C水浴恒温振荡器，购自江苏恒丰仪器厂；[0062]DYY-31A型稳压稳流电泳仪，购自北京六一仪器厂；[0063]DBT-07凝胶成像系统，购自英国UVITEC公司；[0064]ETC811PCR仪，购自北京东胜创新生物科技有限公司；[0065]1.1.4主要试剂和溶液：[0066]E.Z.N.ATMTissueDNAKit，购自OMEGA公司；[0067]ExTaqTM酶、DNAMarkerDL500，购自大连宝生物工程有限公司；[0068]杂交缓冲液，购自上海百傲生物科技有限公司；[0069]0.25%胰蛋白酶，购自生工生物工程上海股份有限公司；[0070]优级胎牛血清四季青），购自北京索莱宝科技有限公司；[0071]5X电泳储存液5XTAE、2.0%琼脂糖凝胶、10%SDS、洗脱液均由本实验室配制。[0072]1.2方法：[0073]1.2•1病毒基因组DNA即模板DNA的提取及注意事项：[0074]1.2.1•1提取病毒基因组DNA的步骤：[0075]对保存的病料采用OMEGA公司的E.Z.N.ATMTissueDNAKit进行基因组DNA的提取具体步骤如下：[0076]1取3〇mg剪碎并研磨的脑组织（全程无菌操作）置于1.5ml的离心管中，力口200ulTL缓冲液。[0077]2加25ul0Bprotease并混匀，55°C水浴30min，间或混匀，使其能够充分反应加入0B的体积由组织决定）。[0078]310000Xg离心5min，取上清另置一新的离心管中，弃去沉淀。[0079]⑷加220ulBufferBL混匀，7TC水浴10min。[0080]⑸加220ul无水乙醇室温），快速混匀15s。[0081]6吸附柱加收集管组合套装中的吸附柱上加入上步的溶液，8,OOOXg离心lmin。[0082]7倒掉上述收集管中的液体，将吸附柱放入另一个收集管中，加入5〇〇ulBufferHB，8000Xg离心lmin。[0083]8倒掉收集管中的液体。将吸附柱放入另一个收集管中，加入含酒精的DNAWashBuffer700ul，8000Xg离心lmin，倒掉收集管中的液体。[0084]⑼重复试验步骤⑻一次。[0085]10将吸附柱放入上一步的收集管中，14000Xg离心2min干燥吸附柱。此步不可省略。[0086]11将吸附柱放入干净的1•5ml无菌离心管中并在吸附柱内加入150u1提前70°C预热好的ElutionBuffer，室温静置3min。10000Xg离心lmin，从吸附柱中洗脱出DNA。[0087]12再次用150ul提前70°C预热好的ElutionBuffer洗脱DNA。将提取的DNA在-201下保存。[0088]1.2•1.2提取过程中的注意事项：[0089]⑴缓冲液BL过量可能会产生微量沉淀，但不影响DNA的恢复，调整缓冲液BL用量必须以初始材料的量为基准。[0090]2应去除不溶解的组织残渣以及不溶颗粒，再移至无菌离心管中，以免堵塞柱子影响后续试验。[0091]⑶洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul，体积过小会影响回收效率;洗脱液的PH值对洗脱效率也有影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在8•0左右可用NaOH将水的pH值调至此范围），pH值低于7•0会降低洗脱效率;回收的DNA产物应保存在-20°C，以防DNA降解。[0092]1.2.2引物的设计与合成：[0093]根据GeneBank中登录的PRVgE基因序列（GeneBank序列号为AY170318，应用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物与探针，上游引物：5’-cttccactcgcagctcttct-3’，下游引物：5’-gtagatgcagggctcgtacac-3’、探针：5’NH2-TTTTTTTTTT-ttactgccacgctggactggtactacg-3’。下游引物5’端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上10个T。引物和探针均由大连宝生物工程有限公司合成合成。先用灭菌水将合成好的冻干引物稀释成l〇〇iiML的母液，再稀释为10yML的浓度置于-20°C冻存备用。[0094]1.2.4基因芯片的制备：[0095]先用TEBuffer将合成好的冻干探针稀释成100yML的母液，再依次稀释成luMLlyL探针+49yL灭菌水+50yL点样缓冲液）、i〇uMLlOuL探针+40uL灭菌水+50uL点样缓冲液）、20uL20uL探针+30uL灭菌水+50uL点样缓冲液）。在96孔U形板的A1孔加入100ul点样缓冲液作空白对照，八2、八3、八5、八6孔分别加入1〇〇此1_凡、5_几、15141几、3〇141凡的探针，使用美国Bio-Dot公司的AD1500基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上接触式点样。点样环境参数为相对湿度55-65%，温度15-30°C，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定为6个矩阵，每个矩阵点样为5x3，点样完毕的芯片静置于8TC烘箱干燥固定2h。芯片点样示意图见图1。[0096]I.2.5杂交用PCR产物的制备与鉴定[0097]对反应条件和参数逐个进行优化，确立最佳浓度和扩增反应条件，杂交用产物需采用不对称PCR。反应总体积为25ul，其组成如下：[0098]10XBuffer：2.5u1；[0099]dNTP2.5mmolL：3.0ul；[0100]上游引物lOuML:1.0ul;[0101]下游引物（10yML:4.0ul;[0102]模板DNA:2.0ul;[0103]ExTaqTM酶：0.25ul;[0104]ddH20：12.75ul；[0105]Total:25.Oul。[0106]试验时先预混合上述反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。[0107]PCR扩增反应条件为：94°C预变性5min，（94°C变性lmin，6TC退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环），72°C延伸lOmin。[0108]取PCR扩增产物5ul与lul6XLording8此『61~，用1〇111移液器混合均匀后，将枪头小心深入到加样孔中，注意不要伸到孔底部，以免穿透加样孔而导致样品外溢，缓慢推出使样品垂直落入加样孔中。[0109]加样结束后，盖上电泳槽盖，调节电压为5vcm80v，关闭电泳室灯光，避光电泳40min。待电泳结束后，小心取出凝胶放置于UVI凝胶成像系统中，观察结果并拍照保存。[0110]1.2.6基因芯片的杂交：[0111]将PCR扩增产物置于PCR仪上98°C变性10min后，立即取出冰浴lOmin，取PCR扩增产物40ul和杂交缓冲液160ul加于离心管中，混匀后取该混合液加到芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将芯片放入杂交盒内，置于47°C杂交箱中避光杂交lh。[0112]1•2.7基因芯片的洗涤和干燥：[0113]芯片的洗涤应在暗室中完成。杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用第一洗液、第二洗液、第三洗液以及第四洗液各浸泡洗涤2min，离心干燥后即可用于扫描分析。[01M]1•2•8基因芯片的扫描及扫描结果分析：[0115]将芯片置于InnoScan700A高性能激光共聚焦扫描伩上扫描，以TIF格式保存图像，然后再另存为为JPG格式图片。用MAPIX软件分析Cy3荧光信号的强度和比值，用以下三个条件作为基因芯片杂交结果判定的依据：[0116]1模板DNA的PCR扩增效果良好；[0117]2信号强度中位值多1〇〇〇,结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰（清晰程度和杂交条件有很大关系）；[0118]⑶检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，它是信号强度中位值与噪音中位值之比，当它们的比值大于或等于1.5时，表明杂交信号良好，即SNR彡1.5。[0119]本发明工艺简单，能对猪伪狂犬病进行快速、灵敏的检测，经试验取得了满意的效果，有关试验结果如下：[0120]^⑶扩增结果[0121]以猪伪狂犬病基因组DNA为模板，与其特异性引物进行不对称PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段大小约为166bp，与预计目的片段相同，特异性较好。[0122]2.2基因芯片杂交结果[0123]不对称PCR扩增产物置于pcr仪上98°C变性lOmin后，立即冰浴l〇min，取该产物40ul和杂交缓冲液ie〇ul加于离心管中充分混合均匀，将该混合液全部加到芯片点样区，将芯片放入杂交盒内，置于47°C水浴锅避光杂交lh。杂交结果经扫描伩扫描，各杂交斑^的SNR值均大于1.5。'[0124]结果表明，采用iMiL的探针浓度就可以达到较高的信号强度，从而降低了检测成本，可用于大规模检测。[0125]本发明操作简便易行，省去了已点样芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需lh，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用lymL的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。[0126]上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。

权利要求：1.一种用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1设计引物和探针：以伪狂犬病的gE基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，上游引物：5’-cttccactcgcagctcttct-3’，下游引物：5’-gtagatgcagggctcgtacac-3,，探针：5’NH2_TTTTTTTTTT-ttactgccacgctggactggtactacg-3’；下游引物5,端用Cy3进行荧光标记，探针的5’端进行氨基化修饰，修饰氨基和探针之间加上1〇个T;⑵按常规方法对引物和探针进行合成；3基因芯片的制备：用TEBuffer溶解合成好的探针，用基因芯片点样仪按预先设定好的程序在醛基化基片上喷点式点样，点样完毕后将芯片静置于8TC烘箱干燥固定2小时。2.根据权利要求1所述的用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述的特异性引物的浓度为1〇yML。3.根据权利要求1所述的用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述探针的浓度为1-30UML。4.根据权利要求1所述的用于检测猪伪狂病犬的基因芯片的制备方法，其特征在于，所述喷点式点样的环境参数为相对湿度55-阳％，温度15-3TC，各探针点间距为1.5mm，点样阵列根据实验要求设定。5.—种用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：1提取待测猪伪狂病病毒的基因组DNA;2杂交用PCR产物的制备:采用不对称PCR扩增，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成份，最后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增，反应总体系为25此，其中10XPCR缓冲液2•5此，2•5mmolLdNTP3.OuL，l〇umL的荧光标记下游引物4.OuL，10UmL的上游引物1•OyL，DNA模板2•OuL，ExTaq™酶0•25uL，灭菌水12.25uL，PCR扩增反应条件：94°C变性5min，94°C变性lmin，60°C变性30s，72°C变性lmin，共30个循环，最后72。3延伸lOmin；3杂交用PCR产物与基因芯片杂交：将杂交用pcr扩增产物置于pcr仪上98°C变性lOmin后，立即取出冰浴lOmin，全程避光;取PCR扩增产物40uL和杂交缓冲液160uL加于离心管中，混匀后将该混合液加至芯片的点样区，将芯片放入杂交盒内，置于47°C杂交箱中避光杂交lh;⑷基因芯片的洗涤与干燥:基因芯片的洗涤应在暗室中完成，杂交完毕的芯片放置在玻片架上，立即用第一洗液、第二洗液、第三洗液以及第四洗液各浸泡2min，上下抽提20次洗涤后离心干燥；5基因芯片的结果分析:将芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值，基因芯片杂交结果判定的依据如下:模板DNA的PCR扩增效果良好;信号强度中位值多1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰;样点信号阈值SNR多1•5，杂交信号良好。6.根据权利要求5所述的用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的应用方法，其特征在于，所述杂交芯片洗涤所用第一洗液为1%柠檬酸钠缓冲液和〇•2%SDS;第二洗液为0.1%柠檬酸钠缓冲液和〇•2%SDS;第三洗液为0•1%柠檬酸钠缓冲液。7.用于检测猪伪狂犬病的基因芯片的应用方法，其特征在于，所述样点信号阈值SNR是信号强度中位值与噪音中位值之比。

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