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申请/专利权人：河南农业大学

摘要：本发明公开了一种基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：（1）基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，测序比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；（2）若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，测序比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株。本发明经序列比对及进化树结果表明，Lectin基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSU rRNA 序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具。

主权项：基于Lectin 基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）基于SSU rRNA位点的扩增：基于SSU rRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；基于SSU rRNA位点扩增的特异性引物：外引物：F1:5'TTCTAGAGCTAATACATGCG3'，SEQ ID NO 1；       R1:5'CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3'，SEQ ID NO 2；内引物：F2:5'GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3'，SEQ ID NO 3；       R2:5'CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3'，SEQ ID NO 4；（2）基于凝集素基因Lectin位点的扩增：若待测样品属于C. parvum、C. hominis、C. cuniculus、horse genotype或驴源C. hominis中的一种，则基于Lectin基因对同种隐孢子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；基于Lectin基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；若两待测样品的Lectin基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种；若两待测样品的Lectin基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；基于凝集素基因Lectin位点扩增的特异性引物：外引物：F1: 5'TCAACTAACGAAGGAGGGGA 3'，SEQ ID NO 5；       R1: 5' GTGGTGTAGAATCGTGGCCT 3'，SEQ ID NO 6；内引物：F2: 5'CGTGCGAATGAAGAAAGA3'，SEQ ID NO 7；       R2: 5'AATCGTGGCCTAAGAGTG3'，SEQ ID NO 8。

全文数据：基于Lectiη基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法技术领域[0001]本发明属于寄生虫的种类鉴定技术领域，具体涉及一种基于Leciin基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法。背景技术[0002]隐孢子虫是一种重要的人兽共患性原虫，被认为是仅次于轮状病毒的第二大重要的腹泻病原体，其宿主范围广泛，可引起急慢性及肠胃炎性腹泻，严重程度与宿主自身的免疫状态有关。隐孢子虫也是因人类免疫缺陷病毒HIV引起的艾滋病和器官移植的机会性病原体。该病已被确定为引起人类腹泻的6大病因之一，常通过水源或食源性污染造成暴发性流行，迄今为止仍无有效的治疗药物，对人类公共卫生造成很大威胁。目前隐孢子虫有效种已达31种，C.parvoffi、C._3〇皿_如_3在人隐孢子虫检测中较为常见，对这两个种以及与它们相近种的隐孢子虫种类的鉴定与分析应进行更深入的研究。目前常用的鉴定隐孢子虫的基因工具是SSUrRNA。该基因分类工具可以鉴别出多种隐孢子虫种类，且由于基因的多拷贝特性，以及存在半保守和高变区域，适合于设计属特异性引物。但SSUrRNA基因的不足之处在于不同拷贝间存在微小的序列差异，这有时会导致某一虫种或基因型RFLP分析结果不一致。因此，区别不同分离株不同拷贝序列内部差异是很有必要的。[0003]目前隐孢子虫种类的确立主要基于以下几个方面：（1卵囊的形态；（2虫体遗传特征；（3自然或试验感染宿主的特异性；⑷符合国际动物命名法规（InternationalCodeOfZoologicalNomenclature。基因型的命名是指在发现有足够的的SSUrRNA基因SmallsubunitribosomeRNA或者其他基因差异，以及需要通过系统发育分析排除这种差异是由于SSUrRNA基因拷贝之间的异质性或者内部基因变化导致的。[0004]理想的分子诊断工具应可鉴定所有的种类或基因型，或者能够检测所有感染人的种类，但是目前只有少数方法可以做到这点，究其原因，在很大程度上因为在隐孢子虫种类和基因型水平上，只有少数基因位点可用。如功能基因小亚基核糖体rRNASSUrRNA基因、卵囊壁蛋白（COWP基因、70kDa热休克蛋白（HSP70基因）、肌动蛋白（actin基因等。在HSP70、C0WP、actin基因中，隐孢子虫种类存在序列多样性，很难设计一个有效的属特异性的基因引物，这点限制了他们在隐孢子虫分子流行病学中的应用。基于SSUrRNA基因的属特异性的PCR-RFLP技术用于鉴别隐孢子虫的种类和基因型，SSUrRNA基因的不足之处在于不同拷贝间存在微小的序列差异隐孢子虫有5个拷贝的SSUrRNA基因），区别不同分离株不同拷贝序列内部差异是很有必要的。COWP基因，为编码隐孢子虫卵囊壁蛋白的基因wallprotein，该基因具有广泛的多态性，可以鉴别部分虫种。HSPs,热休克蛋白家族heatshockproteins，Hsps是一群进化上高度保守的管家基因家族，其功能主要做为分子伴侣辅助蛋白折叠和转运。该家族分子量大小不同，其中Hsp70基因在进化上高度保守且没有内含子，在隐孢子虫基因分型上应用较多。Feng等建立了基于Hsp90基因分型方法用于准确区分感染人的隐孢子虫种（FengY,DearenT,CamaV，etal.90-kilodaltonheatshockprotein,Hsp90，asatargetforgenotypingCryptosporidiumsppknowntoinfecthumans[J]·EukaryotCell,2009，8⑷：478_482.。八：1:;[11基因，是编码肌动蛋白的基因。肌动蛋白是真核细胞中普遍存在的高度保守蛋白之一，由于其非编码序列差异较大，因此可以反映隐孢子虫的进化程度。Sulaiman等对C.parvom,等九种种隐孢子虫及C.parn®内不同基因型虫株的actin基因进行了扩增和比对分析，结果确证了隐孢子不同种类和微小隐孢子虫的不同基因型中间存在遗传学差异，系统进化树分析和之前报道的基于SSUrRNA、Hsp70基因、COWP基因获得的结果大体一致Sulaiman頂，LalAA,XiaoL.MolecularphylogenyandevolutionaryrelationshipsofCryptospordiumparasitesintheActinlocus[J].JParasitol,2002,882:388-394.。基因型的命名规则通常反映隐孢子虫之间的差异，也趋于和生物学特性差异相关联。一些基因型显示与同类属基因序列存在大量的核苷酸差异，彼此间很相似的那些基因主要归因于寄生虫和宿主的共进化。[0005]基因分型不能将人源隐孢子虫与人兽共患的隐孢子虫区分开来，因为这些分型工具分辨率较低，使其在流行病学调查中使用受限。相反，亚型分型工具在对C.parv™和C.Aoffiinis的流行病学研究中得以发展。比如微卫星（microsatellites和小卫星minisatellites工具和60-kDa糖蛋白基因（GP60、及双链（double_stranded，dsRNA成分和rRNA内含子转录间隔区2theinternaltranscribedspacer_2，ITS_2，这些革巴基因较用于分型的位点有较高的进化率。微卫星或者小卫星，是DNA中由1-4个bp的（微卫星）或者更多的（小卫星）重复序列串联组成。由于复制的错误，这些序列比核心区基因的进化率高，往往表现为微卫星或小卫星的串联重复数的变化，因此能够通过PCR产物分级或者用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因扫描技术区别不同亚型。gp60靶点，和微卫星序列相似，是由系列编码丝氨酸的串联核酸序列TCATCGTCT组成，主要用于C.parvuΏ和分类的gp60基因除了三核甘酸串联重复，在非重复区也存在基因差异，根据这些差异和重复，将分为la,lb,Id,Ie,和If等亚家族，把C.parvuΏ分为IIa，IIc，IIcU和IIe等亚家族。在每个亚型家族内，主要根据三联密码子的重复数区分不同亚型。gp60基因是最具多态型的基因，是隐孢子虫亚型鉴定中应用最广的靶点。而gp60是位于隐孢子虫入侵宿主阶段虫体表面顶端的具有中和抗体作用的主要蛋白，因此，它可能与在同一亚型家族中隐孢子虫的生物学特点和临床表现相关。必须注意的是多数的亚型分析工具都是建立在C.parvom或者C.Aoffiinis的基因组序列基础上的，以至于这些工具只能扩增出与这两个种类相近的隐孢子虫如C.fldeagTidis，他们通常不能扩出遗传距离较远的在自然感染人的C.cam_s,C.feiis,C.suis和C.ffiuris等隐孢子虫。[0006]现有的隐孢子虫类工具和体系，在某种程度上把现有的隐孢子虫分为31个种类和60多个基因型，某些亚型分类也用于流行病学和群体遗传研究，但对于和人隐孢子虫C.hoffiim’sSSUrRNA基因相似的兔隐抱子虫（C.ciinicuius、horsegenotype、donkeygenotype、来自袋鼠的与is完全相似的隐孢子虫，及其人和不同动物来源的C.parv™之间的区分依靠gp60基因做亚型分型工具仍难以区分动物来源和不同虫株间的差异。因此探索新的分型工具是当今隐孢子虫分子流行病学调查和溯源研究所需要的。从申请者目前扩增的Lecth基因序列进行在GenBank搜索，仅发现4条相关序列，其中两个为C-parvoznlowa和C.huninis全基因序列。搜索文献也未见该基因位点用于隐孢子虫的分子流行病学和遗传结构分析的报道。[0007]凝集素是一类可以使细胞凝集或者糖复合物沉淀的非免疫来源的糖结合蛋白或者糖蛋白。凝集素大部分来于植物，但是动物、真菌、细菌和病毒也能合成。凝集素及其作用在某些寄生虫上已经得到分析和验证。原虫凝集素功能研究中，溶组织阿米巴凝集因子的功能已经比较清楚:凝集素基因编码凝集素活性的粘附因子，已证明此种粘附活性与溶组织阿米巴虫种毒力相关。溶组织阿米巴对宿主组织的侵袭力特异地表现为一种对靶标物的接触性杀伤功能。这种“触杀”机制，是一个包括对靶细胞和组织的粘附、杀伤、溶噬的连锁生理过程。滋养体表膜现有两种具植物凝血素Lectio活性的粘附因子adhesin能与靶细胞（宿主细胞糖萼中的乙酰氨基葡萄糖GLcNAc和乙酰氨基乳糖胺GalNAc发生受体性结合，提供了对靶细胞进行攻击的前提。Bhat等在微小隐孢子虫和人隐孢予虫子孢子表面分离出一种GalGalNAc特异性凝集素-P30蛋白，其定位于子孢子和胞内阶段虫体的顶端表面介导虫体的黏附及侵入（BhatN，JoeA，PereiraPerrinM，etal.Cryptosporidiump30，aGalactoseN-acetylgalactosamine-specificlectin，mediatesinfectioninvitro[J].JBiolChem2007,282:34877-34887。现有的研究表明，糖结合蛋白或凝集素在原虫识别和粘附宿主细胞过程中起介导作用，这将有助于隐孢子虫的侵袭和致病。Stein等用透射电镜观察具有凝集素的C.parv™能粘附MDCK细胞和HCT-8细胞，同时卵囊对GalGalNAc结合凝集素有高反应，而卵囊中的GalGalNAc亦能帮助入侵宿主细胞SteinB，StoverL，GillemA，etal.TheeffectoflectinsonCryptosporidiumparvumoocystinvitroattachmenttohostcells[J]·JParasitolJT2006,92I:1_9〇Hashim等曾用Gal预处理隐孢子虫卵囊以观察其入侵阻断作用，发现Gal能阻断C.parv™对HCT-8和牛的原代培养小肠上皮细胞侵入（HashimA，MulcahyG，BourkeB，etal.InteractionofCryptosporidiumhominisandCryptosporidiumparvumwithprimaryhumanandbovineintestinalcells[J].InfectImmunJT2006,741:99_107D还有报道称C.parv™是依靠粘液样糖蛋白mucin-likeglycoproteins来粘附和入侵宿细胞的D[0008]在人的凝集素基因的应用上，已经有报道在儿童过敏性紫斑、肺结核易感性等方面尝试应用。隐孢子虫的主要致病机理为虫体侵入宿主的上皮细胞并不断复制而破坏了长上皮细胞导致腹泻等一系列症状。对隐孢子虫的功能基因及其编码蛋白研究一直是人们试图找到该虫控制办法途径，其中该虫的黏蛋白样糖蛋白在试验条件下介导对宿主细胞的粘附和入侵DEdwinson等报道C.parv™和C.s的滋养体发育是经Gal-GalNAc以浓度依赖方式触发的（EdwinsonA，WidmerG，McEvoyJ.GlycoproteinsandGal-GalNAccauseCryptosporidiumtoswitchfromaninvasivesporozoitetoareplicativetrophozoite.IntJParasitol.2016，46l:67_74DVarughese等试验发现用抑制剂处理SHP_2Srchomology-2domain-containingphosphatase2和粧蛋白及SRc家族激酶，有效减少了C.剂量效应的多重感染（ChenXM，LaRussoNF.MechanismsofattachmentandinternalizationofCryptosporidiumparvumtobiliaryandintestinalepithelialcells.Gastroenterology.2000，1182:368-79。研究掲;了SHP-2在C.parv™发病机理中的重要作用。81^131^111從等鉴定了一种C.parv™新的含C型凝集素结构域CTLD的粘附素样糖蛋白ClecCpClec且在C.Aomiis和C.mris有直接同源物在从人到病毒的多种生物中都有含CTLD的蛋白，它是结合蛋白配基，主要功能是附着粘附和信号作用）（BhalchandraS,LudingtonJ,CoppensI,etal.IdentificationandcharacterizationofCryptosporidiumparvumClec,anovelC-typeIectindomain-containingmucin-1ikeglycoprotein.InfectTmmun·2013,819:3356-65。这是从顶复门原虫首次报道含CTLD蛋白，CpClec定位在虫体尖端表面和子孢子及裂殖子的致密颗粒，CpClec在试验感染48小时后表达量最高，暗示其受发育调控。随着对C.parvom黏蛋白样糖蛋白和包含C型凝集素结构域蛋白的认识，表明CpClec在隐孢子虫-宿主细胞间的相互作用中发挥重要作用。[0009]以上研究表明，糖结合蛋白或凝集素在原虫识别和粘附宿主细胞过程中起介导作用，这将有助于隐孢子虫的侵袭和致病，其作用在某些寄生虫上已经得到了分析和验证。这也提示了对黏蛋白样糖蛋白的研究将成为隐孢子虫致病机理的新方向。对于隐孢子虫粘附素功能的研究已经受到广泛关注，而其在分子流行病学和遗传结构分析上，该基因位点的作用仍然没有被重视和挖掘。发明内容[0010]本发明针对现有技术中存在的不足之处，提供一种基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，通过巢式PCR技术，对数种不同隐孢子虫阳性样品进行SSUrRNA及Leciin位点的扩增，并与其它已知的隐孢子虫相关序列比对，构建系统进化树。[0011]本发明的目的是以下述方式实现的：基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：1基于SSUrRNA位点的扩增:基于SSUrRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；基于SSUrRNA位点扩增的特异性引物：外引物：F1:5’TTCTAGAGCTAATACATGCG3’，SEQIDNO1;R1:5’CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3’，SEQIDNO2;内引物：F2:5’GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3’，SEQIDNO3;R2:5’CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3’，SEQIDNO4;2基于凝集素基因Leciin位点的扩增:若待测样品属于C.parvu?2、C.hoffiinis、C.cunicuJus、horsegenotype或驴源C.中的一种，则基于Lecti_n基因对同种隐抱子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Leciin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；基于Lecth基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lecth基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；若两待测样品的Lecth基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种;若两待测样品的Lecth基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；基于凝集素基因Lecth位点扩增的特异性引物：外引物:F1:5’TCAACTAACGAAGGAGGGGA3’，SEQIDNO5;Rl:5’GTGGTGTAGAATCGTGGCCT3’，SEQIDNO6;内引物：F2:5’CGTGCGAATGAAGAAAGA3’，SEQIDNO7;R2:5，AATCGTGGCCTAAGAGTG3，，SEQIDNO8。[0012]步骤⑴中的PCR反应条件:94°C，5min，l个循环;94°C，45s，55°C和55°C，45s，72°C，Imin，35个循环；72°C，IOmin，I个循环。[0013]步骤⑵中的PCR反应条件：94°C，3min，l个循环；94°C，30s，56°C和53°C，30s，72°C，1min，40个循环;72°C，10min，l个循环。[0014]步骤I和步骤2中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。[0015]申请者从事隐孢子虫研究多年，对背景技术中的隐孢子虫基因分型和亚型分型工具的靶标的应用已经实践多次，对于各个基因标记的应用情况和得力程度非常了解。鉴于上述分型工具的局限性，本发明试图找到一个可以应用于区分不同来源的人兽共患种类隐孢子虫的靶标基因。对于目前申请者初步研究的结果来看，凝集素基因Lecth基因位点做革巴标已经很好地区分parvu?2、C.及其在SSrRNA与极为相近的horsegenotype和donkeygenotype，结果见研究基础中图3部分隐孢子虫基于Lectin位点的进化关系）。因此，该基因位点极有可能成为人兽共患隐孢子虫的分类和遗传研究的有效得力的工具，因此有必要进行积极的探索和尝试。[0016]隐孢子虫子孢子对宿主细胞的黏附和侵入是其致病的关键。尽管有数个研究表明隐孢子虫黏附素样蛋白的作用及其宿主细胞的相互作用，不同种类隐孢子虫凝集素基因及其编码蛋白在隐孢子虫侵袭中所起作用大小仍然不是非常清楚。本发明旨在研究不同种类隐孢子虫iecth基因序列差异，旨在为隐孢子虫分子流行病学调查、遗传结构分析和疫病暴发溯源提供新的分子工具。[0017]相对于现有技术，本发明通过对隐孢子虫种分别进行SSUrRNA和LectiM立点的扩增，来探讨Lecth基因作为分型工具的可能性，旨在为隐孢子虫流行病学调查、遗传结构分析和疫病暴发溯源提供新的分子工具。本发明中，经序列比对及进化树结果表明，Lecth基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSUrRNA序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具，是目前隐孢子虫分类工具的有益补充。附图说明[0018]图1是隐孢子虫部分虫种SSUrRNA基因的扩增，M:DNA标准DL2000;1是13-C.canis,2^14-C.canis,3^56-C.baileyi,4^355-C.andersoni,5^166-C.ffluris167-C.腫ris，7是8Uo?u_m_s，8是201-6\ρ3ί·ν™，9是SCA667-C.cum_cuius，10是268-horsegenotype-Donkey，11是89-C.Donkey，12是阳性对照，13是阴性对照。[0019]图2是隐孢子虫部分虫种Lectin基因的扩增，M:DNA标准DL2000;1是13-C.cam's，27^14-0.canis,3t^56~C.baiIeyi,4^355-C.andersoni,5t^166~C.muris,6^167-6'.皿!'1_3,7是8-6'._3〇皿__〇1_3,8是201-6^3!'7隨，9是3〇厶667-6'.；〇〇1_^』狀，10是268-11〇『86genotype-Donkey，11是89-C.hoffiim·s-Donkey，12是阳性对照，13是阴性对照。[0020]图3是基于Lecth基因位点的隐孢子虫种系发育分析图。[0021]图4是ClustalX的结果对照图。具体实施方式[0022]本发明中基于Lecth基因鉴定部分隐孢子虫的种类，所述的部分隐孢子虫是指C.ciinicuius及其在SSUrRNA处与人源C.极为相近的horsegenotype、驴源C.hondnis〇[0023]KOD-plus酶购自郑州科贸生物技术有限公司，由日本Τ0Υ0Β0公司生产。[0024]基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，具体步骤如下：1基于SSUrRNA位点的扩增:基于SSUrRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；基于SSUrRNA位点扩增的特异性引物：外引物：F1:5’TTCTAGAGCTAATACATGCG3’，SEQIDNO1;R1:5’CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3’，SEQIDNO2;内引物：F2:5’GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3’，SEQIDNO3;R2:5’CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3’，SEQIDNO4;2基于凝集素基因Leciin位点的扩增:若待测样品属于C.parvu?2、C.hoffiinis、C.cunicuJus、horsegenotype或驴源C.中的一种，则基于Lecti_n基因对同种隐抱子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Leciin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；基于Lecth基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lecth基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；若两待测样品的Lecth基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种;若两待测样品的Lecth基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；基于凝集素基因Lecth位点扩增的特异性引物：外引物:F1:5’TCAACTAACGAAGGAGGGGA3’，SEQIDNO5;Rl:5’GTGGTGTAGAATCGTGGCCT3’，SEQIDNO6;内引物：F2:5’CGTGCGAATGAAGAAAGA3’，SEQIDNO7;R2:5，AATCGTGGCCTAAGAGTG3，，SEQIDNO8。[0025]步骤⑴中的PCR反应条件:94°C，5min，l个循环；94°C，45s，55°C和55°C，45s，72°C，Imin，35个循环；72°C，IOmin，I个循环。[0026]步骤2中的PCR反应条件:94°C，3min，I个循环;94°C，30s，56°C和53°C，30s，72°C，1min，40个循环;72°C，10min，l个循环。[0027]步骤⑴和步骤⑵中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。[0028]1.隐孢子虫阳性样品的收集隐孢子虫阳性样品共56份，包括52份实验室保存的在SSUrRNA位点进行过巢式PCR并鉴定为阳性的样品（16份C.parvom、16份人源C.A〇ffiim_s、5份驴源C.1份驴源Horsegenotype、4份C.andersom’d个C.cam_s、3个C.皿ris、2个C.foaiiey和2个C.ubiguiiua，以及澳大利亚莫道克大学媒介与水传病原研究团队VectorWater-BornePathogenResearchGroup保存的来源于袋鼠的4份C.cmicuius，样品信息见表1〇2.基于SSUrRNA位点的PCR的扩增2.1SSUrRNA位点的引物SSUrRNA引物参考Xiao的方法在生工合成（XiaoL，EscalanteL，YangC，etal.PhylogeneticanalysisofCryptosporidiumparasitesbasedonthesmall-subunitrRNAgenelocus[J].Appliedandenvironmentalmicrobiology,1999,654:1578-1583。[0029]基于SSUrRNA位点扩增的特异性引物：外引物：F1:5’TTCTAGAGCTAATACATGCG3’，SEQIDNOI;R1:5’CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3’，SEQIDNO2;内引物：F2:5’GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3’，SEQIDNO3;R2:5’CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3’，SEQIDNO4。[0030]2.2基于SSUrRNA位点的扩增基于SSUrRNA基因对所有阳性样品进行巢式PCR的扩增，每次PCR扩增均设阳性对照样品和阴性对照样品。[0031]?0?反应体系见表2，？0?反应条件:94°：，51^11，1个循环;94°：，458,55°：和55°：，45s，72°C，Imin，35个循环；72°C，IOmin，1个循环。[0032]2.3电泳取5μ1的第二套PCR产物加入2μ1的DNAGreen于琼脂糖凝胶电泳中扩增，电泳结束后在电泳凝胶成像系统仪中观察拍照，隐孢子虫部分虫种SSU18srRNA基因的扩增的凝胶成像图如图1所示。[0033]2.4测序隐孢子虫阳性样品经SSUrRNA位点扩增后的第二套PCR产物，纯化后直接进行测序。每个样品均进行双向测序，测序委托北京诺赛基因有限公司完成，测序仪为ABIPRISMTM3730XLDNAAnalyzerAppliedBiosystems，USA〇[0034]2.5确认样品的种属双向测序后的样品在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，应用ClustalX1.83软件进行比对分析，对照比对结果和测序峰图，获得校准序列，如图4所示，确认待测样品所属的隐孢子虫种类，结果如表1所示。[0035]3.基于LeciiM立点的PCR的扩增3.1Leciin位点的引物Lectin的引物外引物F1、R1参照ZahediA合成（ZahediA,MonisP,AucoteS,etal.ZoonoticCryptosporidiumspeciesinanimalsinhabitingSydneywatercatchments[J]·PloSone,2016,1112:e0168169·，内引物用MacVectorl2.6软件设计，委托生物公司合成。[0036]基于凝集素基因LectiM立点扩增的特异性引物：外引物:F1:5’TCAACTAACGAAGGAGGGGA3’，SEQIDNO5;Rl:5’GTGGTGTAGAATCGTGGCCT3’，SEQIDNO6;内引物：F2:5’CGTGCGAATGAAGAAAGA3’，SEQIDNO7;R2:5，AATCGTGGCCTAAGAGTG3，，SEQIDNO8。[0037]3.2基于凝集素基因LeciiM立点的扩增经SSUrRNA扩增后，对于属于C.parvom、C._hoM_m_s、C.cunicuius、horsegenotype或驴源C.Aom_m_s种属的待测样品基于Lectin基因再次进行巢式PCR扩增，每次PCR扩增均设阳性对照样品和阴性对照样品。[0038]PCR反应体系见表2,PCR反应条件：94°C，3min，1个循环；94°C，30s，56°C和53°C，30s，72°C，lmin，40个循环;72°C，10min，l个循环。[0039]3.3电泳取5μ1的第二套PCR产物加入2μ1的DNAGreen于琼脂糖凝胶电泳中扩增，电泳结束后在电泳凝胶成像系统仪中观察拍照，隐孢子虫部分虫种Lecth基因的扩增的凝胶成像图如图2所示。[0040]3.4测序隐孢子虫阳性样品经Lecth位点扩增后的第二套PCR产物，纯化后直接进行测序。每个样品均进行双向测序，测序委托北京诺赛基因有限公司完成，测序仪为ABIPRISMTM3730XLDNAAnalyzerAppliedBiosystems，USA〇[0041]3.5确认样品的种属双向测序后的样品在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，应用ClustalX1.83软件进行比对分析，对照比对结果和测序峰图，获得校准序列，如图4所示，确认待测样品所属的隐孢子虫种类，以及同种隐孢子虫的不同分离株。[0042]3.6种系发育分析种系发育进化树使用MEGA5软件建立，同时结合MegAlign建立的同源性结果进行序列的分析，种系发育分析图如图3所示，用于建立进化树的隐孢子虫种的Lecth位点的碱基序列如SEQIDN09-SEQIDN020,201-C.parnm-Cattle:SEQIDN09，14793-C.parnm-Human：SEQIDNO10,KX375354.ICparvum：SEQIDNO11,15281-C.Hominis-Euman：SEQIDNO12,SCA782-C.hominis~]{angaroo：SEQIDNO13,KX375352.1C.hominis：SEQIDNO14,SCA675-C.c™icuius-Rabbit：SEQIDNO15,KX375351.1C.cunicuius：SEQIDNO16,268-horsegenotype-Donkey：SEQIDNO17,S13-C._h〇ffli_nis-Donkey：SEQIDNO18,l06-C.hominis~Oonkey：SEQIDNO19,89~C.hominis-Oonkey：SEQIDNO20〇[0043]4.结果4.1PCR对不同隐孢子虫种的扩增结果经Lecth基因引物共扩增了56份样品，其中42份隐孢子虫阳性样品在SSUrRNA基因位点和Lectin位点均已成功扩出，这些样品分属于C.parvom、C.cunicuius、Horsegenotype。而C.andersoni、C·cards、C.muris、C·foaiJey和C.ubiquitum，在SSUrRNA位点能够扩增目的序列，在Lectin位点却未能扩增出目的条带。在Lectin位点校准过的测序结果与GeneBank仅有的几条序列Blast结果相似。[0044]由图1和图2可知，SSUrRNA位点可区分C.cam·s、C.foaiJeyi、C.andersom·、C.muris.hominis.parvum^C.cuniculusNHorsegenotype和驴源C.hominis，而点不會泛区分C.cam’s、C.foaiJeyi、C.a_ndersom•和C.ffiuris，只會泛区分、C·parvum、C·cuniculusNHorsegenotype和驴源C.hominis。[0045]4.2序列比对与同源性分析将42份Lecth基因扩增产物测序结果进行分析，同时与参考序列进行了比对，ClustulX比对结果显示:不同种类的隐孢子虫，重复序列碱基组成不同（数量不等的编码谷氨酰胺的CAA三联密码子），同种隐孢子虫不同分离株或不同来源的重复序列数目不同，其中，C.parvum、C·hominis^C.cum.cuJus、驴源C.honim.s和Horsegenotype的连续的CAA个数见表3。此外，在6个C.parvuΏLeciin位点序列中发现样品431在56位点处碱基为T，而其它5个C.parv™的碱基为G，在302-307位点之间碱基缺失，其它5个C.parv™的碱基为ACTACC。可能是样品431与其它5个C.parvom的亚型不同，其具体结果有待进一步的验证。[0046]由于比对序列较多，本发明选取9个隐孢子虫分离株的序列：C.parvuΏ20115389、C.honim.s15281SCA782、C.cum_cuJusSCA675、驴源C.iwnim.s89106S13-R和Horsegenotype268-R与参考序列KX375354.1、ΚΧ375352·1及KX375351.1进行同源性的分析。参考序列信息见表4。[0047]同源性分析结果表明，在Leciin基因位点上C.parvom的这两个分离株，宿主来源不同，其中来源于牛的201号样品与KX375354.1同源性为97.1%，而来源于人的15389号样品与KX375354.1同源性为92.4%;C.Aomiis的两个分离株间宿主来源不同，同源性高达99.8%，但与KX375352.1的同源性是100%;C.cum_cuJus与KX375351.1的同源性为100%;3个驴源C.s间同源性在99.1%〜99.7%之间，与KX375352.1的同源性为98.8%。遗传进化树及同源性结果表明，不同种类的隐孢子虫分布在不同的进化分支上，同种隐孢子虫也因虫株来源不同，显示遗传距离的远近，见图3。[0048]括号中的样品与代表样品序列相同，处于同一分支上：SCA782-C.hominis-Kangaroo8,23,402,14592,15281,15402,14581,15479,14671,14638,15410,15429,SCA718,SCA631,SCA849；201-C.paryuffl-Cattle207,224,239,339,123,BD,NX,15389,15289,431,14793,15324,15465,15490,SCA642；SCA675-C.c™icuius-RabbitSCA678,SCA667,SCA663；S13-C.hominis-Oonkey89,58,59,106〇[0049]4.3不同种类隐孢子虫凝集素Lecth基因的扩增Lecth基因是编码隐孢子虫毒力因子的基因，其编码的蛋白质位于子孢子和裂殖子的顶端区域，可能与虫体的黏附、侵入及胞内的发展有关。研究表明，在很多寄生性的原虫中，凝集素Lecth或者与糖结合的蛋白质都能介导原生动物黏附宿主细胞、增强细胞的毒性及补体的抗药性，并能促进形成囊体或包囊壁，可能与隐孢子虫的致病性有关。本试验是在尝试使用Lecth基因位点作为分析工具时发现不同隐孢子虫种类在该位点的序列不同，尤其是不同种隐孢子虫有数量不等的CAA三联密码子重复序列，根据其他原虫相关研究，如溶组织阿米巴凝集素蛋白对阿米巴致病力的影响，推测该基因编码蛋白影响隐孢子虫的入侵、繁殖和致病力。在对Leciin位点进行引物的设计时，Leciin基因序列仅在C.parv™、C.力0?21_21_3和6'.：^1_^]^上有少量报道，而其他隐孢子虫16^1_2基因存在与否及序列特性知之甚少，为此本实验选用全基因组序列中已上传的全基因测序完成的C.parv™和C.力0?21_21_3的^^1_2基因作为研究对象，设计隐孢子虫属特异性的巢式PCR引物，试图扩增出其他种的隐孢子虫Lecth基因序列。试验之初，曾对实验室保存的其他隐孢子虫如C.andersoni、C·baileyi^C.canis、C·ubiquitum^C.muris一并进了扩i曾，但仅在C.parvu?2、C._h〇ffiim_s、C.cunicuJus、horsegenotype扩增出了目的基因。分析原因，可能是设计Leciin基因引物是基于C.parvom、C._hom_m_s的基因序列设计的，所以只能扩增出这两个种或者与之相近的隐孢子虫种或基因型。NCBI上已公布的全基因组序列中，C.mris在1^^：^位点上与6'.口31-叩?2、6'._30?2：^3序列差别很大，这也是6'.腫1^等在本次试验中无法扩增出目的条带，而C.parvom、C.Aom_m_s及其相近虫种可以顺利扩增的主要原因。[0050]4.4在LectiM立点处对隐孢子虫相近种的扩增比SSUrRNA处有更好的区分度挑选本实验中的11个样品（6个C.parvom、2个C.6〇皿_^和3个驴源C.分别进行SSUrRNA和Lecth的扩增，将第二套扩增产物送去测序，拼接序列后进行ClustalX比对。比对结果显示:在SSUrRNA位点处，仅能区分出不同的隐孢子虫种，而同种隐孢子虫不同分离株间的差别无法区分开来。而在Leciin位点处，能把C.parvom和C.Aom_m_s这两个隐孢子虫种及驴源很好地区分开来。同时，通过用Leciin位点扩增C.parvoffi，C._h〇ffii_nis，C.cunicuius，horsegenotype，驴源、袋鼠源C.几种隐抱子虫基因型时，发现在不同种类的隐孢子虫分离株中，其重复序列的碱基组成不同，同种隐孢子虫不同样品中重复序列的碱基数目不同。这也表明，Lecth基因有望成为新的隐孢子虫标记基因，补充现有基因位点对隐孢子虫分型分类的不足。[0051]目前，国内外将Lecth基因位点用于隐孢子虫种类和基因型的鉴定，仅少量报道。本发明通过对不同隐孢子虫分离株在LectiM立点进行扩增，并将部分隐孢子虫种分别进行SSUrRNA和Leciin位点的扩增，以此来探讨Leciin基因作为分型工具的可能性，旨在为隐孢子虫流行病学调查、遗传结构分析和疫病暴发溯源提供新的分子工具。本发明中，经序列比对及进化树结果表明，Lecth基因作隐孢子虫鉴定工具用于SSUrRNA序列相近隐孢子虫种的鉴定有更好的区分度，可望为隐孢子虫的分子流行病学、群体遗传分析增添新的分子工具，是目前隐孢子虫分类工具的有益补充。[0052]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

权利要求：1.基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：具体步骤如下：1基于SSUrRNA位点的扩增:基于SSUrRNA基因对待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，确定待测样品是否为隐孢子虫阳性，以及属于哪一种隐孢子虫种；基于SSUrRNA位点扩增的特异性引物：外引物：F1:5’TTCTAGAGCTAATACATGCG3’，SEQIDNO1;Rl:5’CCCATTTCCTTCGAAACAGGA3’，SEQIDNO2;内引物：F2:5’GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG3’，SEQIDNO3;R2:5’CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA3’，SEQIDNO4;2基于凝集素基因Leciin位点的扩增：若待测样品属于C.parvu?2、C.、C.cunicuJus、horsegenotype或驴源C.中的一种，则基于Lecti_n基因对同种隐抱子虫不同分离株的待测样品进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Leciin基因位点上的连续的CAA三联密码子的个数确定待测样品是否为同种隐孢子虫不同分离株；基于Lecth基因对不同种隐孢子虫不同分离株进行巢式PCR扩增，扩增得到第二套扩增产物，测序，拼接序列后进行ClustalX比对，通过待测样品的Lecth基因位点上重复序列碱基组成不同，来确定待测样品是否为不同种类隐孢子虫；若两待测样品的Lecth基因位点处重复序列碱基组成不同，则此两待测样品属于不同隐孢子虫种;若两待测样品的Lecth基因位点上重复序列碱基组成相同，但其连续CAA三联密码子的个数不同，则此两待测样品属于同种隐孢子虫的不同分离株；基于凝集素基因Lecth位点扩增的特异性引物：外引物:Fl:5’TCAACTAACGAAGGAGGGGA3’，SEQIDNO5;Rl:5’GTGGTGTAGAATCGTGGCCT3’，SEQIDNO6;内引物:F2:5’CGTGCGAATGAAGAAAGA3’，SEQIDNO7;R2:5，AATCGTGGCCTAAGAGTG3，，SEQIDNO8〇2.根据权利要求1所述的基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于：步骤⑴中的PCR反应条件:94°C，5min，l个循环;94°C，45s，55°C和55°C，45s，72°：，1111丨11，35个循环；72°：，1〇111丨11，1个循环。3.根据权利要求1所述的基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于:步骤⑵中的PCR反应条件:94°C，3min，1个循环;94°C，30s，56°C和53°C，30s，72°C，1min，40个循环;72°C，10min，l个循环。4.根据权利要求I所述的基于Lecth基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法，其特征在于:步骤1和步骤2中的PCR反应体系中使用的酶为KOD-plus酶。

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