申请/专利权人：国家海洋局第三海洋研究所

申请日：2015-11-26

公开（公告）日：2016-02-10

公开（公告）号：CN105316330A

主分类号：C12N15/11(2006.01)I

分类号：C12N15/11(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/70(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.07.02#未缴年费专利权终止;2019.03.05#授权;2016.04.27#实质审查的生效;2016.02.10#公开

摘要：本发明公开了一种同时检测对虾HPV、MBV和IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途。所述引物分别为HPV-F和HPV-R、 MBV-F和MBV-R、IHHNV-F和IHHNV-R，序列如SEQ ID NO:1和 2，SEQ ID NO:3和 4，SEQ ID NO:5和 6所示。本发明的引物彼此间无交叉，且不与其它病毒产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株，具有广泛适用性，具有非常高的特异性和敏感性，检测限低。同时对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。

主权项：一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分别为HPV‑F和HPV‑R、 MBV‑F和MBV‑R、IHHNV‑F和IHHNV‑R，序列如SEQ ID NO:1和 2，SEQ ID NO:3和 4，SEQ ID NO:5和 6所示。

全文数据：一种同时检测对虾HPV、MBV和IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途技术领域本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体涉及一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒Hepatopancreaticparvovirus,HPV、斑节对虾杆状病毒Monodonbaculovirus,MBV、传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus,IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途。背景技术对虾肝胰腺细小病毒Hepatopancreaticparvovirus,HPV属于细小病毒科，浓核病毒亚科，平均直径22-23nm，有包涵体，单链DNA病毒ssDNA，无包膜二十面体。其在病毒学中属于慢性感染类型，传染性强，发病率高。对虾感染肝胰腺细小病毒后,肝胰腺上皮细胞肿大，变性，尤其在疾病充分发展期的病虾肝胰腺、鳃组织，以及后胃和前中肠粘膜层细胞坏死解体，最后肝胰腺仅剩下一团结缔组织，以至病虾失去消化吸收功能，呼吸器官也遭到严重损害，造成窒息而死。对虾肝胰腺细小病毒是已知的导致对虾生长缓慢的主要细小病毒之一。HPV已在世界各地的野生对虾和养殖对虾中被发现。其致病率高，分布广，对对虾养殖业可造成巨大的经济损失。HPV很少单独感染对虾，多与其他多种病原性的病毒发生混合感染，并且在大多数情况下，重感染的对虾却没有明显的炎症反应。致病虾生长变缓、活动呆滞、食欲减退、较少蜕皮，虾体表常有杂物附着；成虾甲壳变软，腹部肌肉变白，常并发二次性细菌感染，以弧菌较为常见。迄今为止，还没有有效的预防措施可减少对虾的感染。斑节对虾杆状病毒Monodonbaculovirus,MBV又名草虾杆状病毒病grassshrimpbaculovirus、因首次在斑节对虾Penaeusmonodon中发现而得名。1987-1988年MBV在台湾等地区爆发流行，1991年在大陆发现。在中国、泰国、新加坡、印度尼西亚、马来西亚均有广泛分布。斑节对虾杆状病毒属杆状病毒科，核型多角体病毒属A亚群。病毒为杆状，有囊膜，有包涵体，为双链DNA病毒dsDNA。核衣壳大小为42×246nm，连囊膜大小约为75×324nm。不同种类的虾所观察到的病毒颗粒大小略有差异。斑节对虾杆状病毒感染部位是肝胰腺及前中肠的上皮细胞核，并在细胞核内产生多个嗜酸性的圆形或椭圆形的病毒包涵体。致病虾食欲减少，活动呆滞，鳃、附肢和体表常带有大量的附生生物。受感染后幼体除部分体色加深外，并无特别症状，多数携带病毒的虾活动正常。受感染幼体群常常无明显的症状表现而出现大量死亡，更因继发感染其它病毒、细菌或附生物而导致幼体大量死亡。传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus,简称IHHNV最初于1981年在美国夏威夷地区养殖细角滨对虾Litopenaeusstylirostris中被发现Lightneretal，1983。传染性皮下及造血组织坏死病毒是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一，属于细小病毒科Parvoviridae短浓核症病毒属Brevidensovirus。是目前已知的对虾病毒中颗粒最小的一种，直径22nm，单链DNA细小病毒ssDNAParvovirus无包膜，20面体对称的球状颗粒。IHHNV感染对虾的部位，包括外胚层组织，如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节，以及中胚层器官，如造血组织、触角腺、性腺、淋巴器官、结缔组织和横纹肌。在宿主细胞核内形成包涵体。患此病的病虾身体变形，引起慢性感染为主。死亡率不高，但严重影响经济效益。IHHNV的敏感宿主是细角滨对虾Litopenaeusstylirostris和凡纳滨对虾Penaeusvannamei，自然状态下可感染大部分养殖对虾,引起细角滨对虾的发病和死亡，在凡纳滨对虾，则表现为慢性矮小残缺综合症runt-deformitysyndrome,RDS。同时也是南美白对虾常见的一种慢性致病病毒。在人工养殖中，对虾可同时感染多种病毒。HPV和MBV在虾类养殖业中经常出现混合感染，给对虾养殖业及海洋资源的可持续发展带来严重威胁。因此，对病毒进行检测和监控就显得意义非常重大。目前,对虾病毒病的诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法,分子杂交及PCR。已建立的常规PCR技术，常是一次只能检测一种样本，比较费时间。而多重PCR技术是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病毒特异性引物，能够同时检测多种病原体，从而缩短病毒检测的周期，提高检测效率。但多重PCR检测也受多种因素的影响，比如DNA聚合酶的活性、模板的质量、所设计的病毒引物的特异性、PCR反应条件、不同病毒样本间对试剂的竞争等因素都会影响检测结果的敏感性和准确性。基于当前现状，需建立一种准确、快速、简便的对虾病毒检测方法，以利于对病毒的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。发明内容本发明的目的在于提供一种方便快捷，检测限低，且特异性强、灵敏度高、准确率高、且能同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测方法。为实现上述目的，本发明提供一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分别为HPV-F和HPV-R、MBV-F和MBV-R、IHHNV-F和IHHNV-R，序列如SEQIDNO:1和2，SEQIDNO:3和4，SEQIDNO:5和6所示。一方面，本发明还提供一种用于同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，含有所述的引物对。另一方面，提供所述多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的用途。另一方面，提供多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的方法。进一步，步骤为，提取DNA,PCR检测，采用所述多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物；阳性对照为SEQIDNO:7，SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的核酸序列混合作为模板，阴性对照为：不含有对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病毒的任意DNA核酸序列；结果判定，当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为90-120bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阳性；如果没有90-120bp条带，则为对虾肝胰腺细小病毒阴性；当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为180-220bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阳性；如果没有180-220bp条带，则为斑节对虾杆状病毒阴性；当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为270-320bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；如果没有270-320bp条带，则为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性；当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。进一步，所述PCR检测的PCR反应体系为：25μL反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的TaqDNA聚合酶缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，各引物终浓度为0.4μM，提取好待检测的DNA模板1μL。进一步，所述PCR检测的PCR反应条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃30秒，55℃30秒，72℃20秒，35个循环；72℃10分钟，1个循环；4℃保存。本发明根据对虾肝胰腺细小病毒Hepatopancreaticparvovirus,HPV、斑节对虾杆状病毒Monodonbaculovirus,MBV、传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus,IHHNV的核酸序列，分别设计用于检测肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下：对虾肝胰腺细小病毒上游引物：HPV-F:CAATTAGAACGCATAGAAAACGSEQIDNO:1下游引物：HPV-R：CCGCACTTACCTCTTGTCTCSEQIDNO:2斑节对虾杆状病毒上游引物：MBV-F:GCAAGACCCTCTACCGATATGSEQIDNO:3下游引物：MBV-R：AAGGAGTGCAGATCTTGAAAATSEQIDNO:4传染性皮下及造血组织坏死病毒上游引物：IHHNV-F:ACAGCAGCAAACTATGAAGACCSEQIDNO:5下游引物：IHHNV-R：GCAGCCAAGTTTAAGTTCGTSEQIDNO:6阳性质控品阳性质控品：包括对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的核酸DNA。分别为人工合成含有上述引物扩增目的片段的如下序列：HPV:CAATTAGAACGCATAGAAAACGCTAAGAAATACATAGAAGAAGTTATAGAAGAAACTAATCAAGAGTTAGAAAATCAAGAGAGACAAGAGGTAAGTGCGGCGGAGGCAGATACGATGAACACTGAAGCACCTGTCCCGATGGAAACTTCTGAATCAGGGACTACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCAGCGGGCGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGAGGCGAATCAGCAGGGTACGGGAGAAACTCTAGCGATTCATTCCAGCGCCACCGCAACAAACCTATCGATCTSEQIDNO:7；MBV:ACCATAAGCTAGCATACGTCCTTTTGAATTTTTATACTGTTCTATGCATTTTGCAAGACCCTCTACCGATATGGTATCAATGTCTGGAGTTATATTATTTTTTATATAATTGAGTGTTTTTTGCTGACCTTTTGAAATTGCATTTTTATAGATAAATAAAGAATCATCGAGATCCTTCATTTATAATTGTCTTTATCTTTTTGTATAGCGTGTTAACGCTATAAAGATTTTCAAGATCTGCACTCCTTSEQIDNO:8；IHHNV:TCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCGACGTAACATTGGCAAAATGGATACAAAATCCCCAACTTGTGACCGTACAATCAACAGCAGCAAACTATGAAGACCCAATCCAACAATTTGGATTCATGGAACAAATGCGAACCGGTGACAGAAAAGCCTATACAATCCATGGTGACACTAGAAATTGGTATGGCGGAGAAATACCAACAACCGGACCCACCTTCATCCCAAAATGGGGTGGTCAATTAAAATGGGACAAACCATCCCTTGGAAACCTAGTCTACCCAGCAGACCACCATACAAACGACTGGCAACAGATCTTCATGAGAATGTCACCAATCAAAGGACCAAATGGAGACGAACTTAAACTTGGCTGCSEQIDNO:9。本发明提供了一种依赖于PCR的分子检测试剂盒及检测方法，为对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的同时检测提供一种快速、简便、准确的检测方法及试剂盒。通过对引物的设计与筛选，使得检测的灵敏度更高，特异性更好。检测限低至10拷贝μL，提高了检测水平。所建立的多重PCR体系可重复性好，稳定性强。该试剂盒为对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测提供更有效的检测方法，具有广泛的应用前景。本发明所选的3种病毒引物均是对应3种病毒的专用检测引物，特异性强。是本发明的申请人经大量的试验验证后，筛选出的三对具有非常高的特异性的引物，具有非常好的敏感性，检测限低。高通量、低成本、高效率。本发明所涉及的三种病毒包括世界各地的病毒株，各自都有多种不同的病毒株，一种病毒的不同病毒株的基因序列有的很保守，有的变异性比较大。并且不同病毒之间还存在交叉反应，在综合比对这些病毒株的序列后，申请人选择了一种病毒不同病毒株之间保守性好的序列，从而能够确保检测出这种病毒的不同病毒株。因此本发明在设计引物时，考虑到一种病毒与其他病毒的基因之间的序列差别，使得在检测时，假阳性率低。避免与其他病毒发生交叉，申请人设计了很多对引物，再进行大量的试验验证，从而筛选出用于本发明的这3对引物。这3对病毒引物彼此间无交叉，且不与其它病毒产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株，具有非常好的特异性，广泛适用性和实用性。本发明对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。克服了以往单一检测的操作繁琐、灵敏度低、适用性低等诸多限制。附图说明图1为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验结果图；图2为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的敏感性实验图；图3为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的敏感性实验图；图4为多重PCR体系中3种对虾病毒混合检测的敏感性实验图；图5为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的特异性实验图；图6为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的特异性实验图；图7为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的特异性实验图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1：检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒试验1试剂10×TaqBuffer：Tris-HCl100mM，KCl500mM，MgCl220mM，dNTPs2mM，Taq酶1UμL；引物：HPV-F、HPV-R、MBV-F、MBV-R、IHHNV-F、IHHNV-R各10μM，纯水，阳性质控品DNA10μgml；本发明根据对虾肝胰腺细小病毒Hepatopancreaticparvovirus,HPV、斑节对虾杆状病毒Monodonbaculovirus,MBV、传染性皮下及造血组织坏死病毒Infectioushypodermalandhematopoieticnecrosisvirus,IHHNV的核酸序列，分别设计用于检测肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下：对虾肝胰腺细小病毒上游引物：HPV-F:CAATTAGAACGCATAGAAAACGSEQIDNO:1下游引物：HPV-R：CCGCACTTACCTCTTGTCTCSEQIDNO:2斑节对虾杆状病毒上游引物：MBV-F:GCAAGACCCTCTACCGATATGSEQIDNO:3下游引物：MBV-R：AAGGAGTGCAGATCTTGAAAATSEQIDNO:4传染性皮下及造血组织坏死病毒上游引物：IHHNV-F:ACAGCAGCAAACTATGAAGACCSEQIDNO:5下游引物：IHHNV-R：GCAGCCAAGTTTAAGTTCGTSEQIDNO:6阳性质控品：包括对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的核酸DNA。分别为人工合成生工生物工程上海股份有限公司，以下均同此含有上述引物扩增目的片段的如下序列：HPV:CAATTAGAACGCATAGAAAACGCTAAGAAATACATAGAAGAAGTTATAGAAGAAACTAATCAAGAGTTAGAAAATCAAGAGAGACAAGAGGTAAGTGCGGCGGAGGCAGATACGATGAACACTGAAGCACCTGTCCCGATGGAAACTTCTGAATCAGGGACTACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCAGCGGGCGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGAGGCGAATCAGCAGGGTACGGGAGAAACTCTAGCGATTCATTCCAGCGCCACCGCAACAAACCTATCGATCTSEQIDNO:7；MBV:ACCATAAGCTAGCATACGTCCTTTTGAATTTTTATACTGTTCTATGCATTTTGCAAGACCCTCTACCGATATGGTATCAATGTCTGGAGTTATATTATTTTTTATATAATTGAGTGTTTTTTGCTGACCTTTTGAAATTGCATTTTTATAGATAAATAAAGAATCATCGAGATCCTTCATTTATAATTGTCTTTATCTTTTTGTATAGCGTGTTAACGCTATAAAGATTTTCAAGATCTGCACTCCTTSEQIDNO:8；IHHNV:TCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCGACGTAACATTGGCAAAATGGATACAAAATCCCCAACTTGTGACCGTACAATCAACAGCAGCAAACTATGAAGACCCAATCCAACAATTTGGATTCATGGAACAAATGCGAACCGGTGACAGAAAAGCCTATACAATCCATGGTGACACTAGAAATTGGTATGGCGGAGAAATACCAACAACCGGACCCACCTTCATCCCAAAATGGGGTGGTCAATTAAAATGGGACAAACCATCCCTTGGAAACCTAGTCTACCCAGCAGACCACCATACAAACGACTGGCAACAGATCTTCATGAGAATGTCACCAATCAAAGGACCAAATGGAGACGAACTTAAACTTGGCTGCSEQIDNO:9。阴性质控品：不含HPV、MBV或IHHNV这三种病毒的任何DNA质粒以上三种病毒核酸片段分别转入载体后，挑取阳性克隆菌落培养并提取质粒测其浓度后作为阳性质控品。检测方法及步骤：病毒核酸DNA的提取：取疑似对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒等病毒发病对虾内脏组织约0.1g，加入400μL裂解液15mmolLNaCl,10mmolLTris-HCl,10mmolLEDTA,1％SDS,pH8.0研磨均匀，加入蛋白酶K，终浓度为100μgml，震荡混匀后于55℃温育1-2h。在反应液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇25:24:1混匀，去除残余蛋白，10000rmin离心10min后取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇24:1混匀，10000rmin离心10min，转移上层水相，加入110体积3molL乙酸钠pH5.2,再加入2倍体积无水乙醇,混匀，12000rmin离心5min，沉淀用75％冷乙醇洗涤2次，室温晾干后加入50μLTE，于-20℃保存备用。多重PCR扩增：所述的多重PCR反应体系为25μL，反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的TaqDNA聚合酶缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，各引物终浓度为0.4μM，提取好待检测的DNA模板1μL，纯水补足至25μL，同时按上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品1μL进行扩增。将各反应管放入PCR仪的反应槽内，设定多重PCR仪反应程序，进行多重PCR反应。以检测所检测的对虾是否感染对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒。设定多重PCR反应条件为：95℃3分钟，1个循环；95℃30秒，55℃30秒，72℃20秒，35个循环；72℃10分钟，1个循环；4℃保存。扩增产物检测与分析：1.5％WV琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。结果判定：当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为90-120bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阳性；当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为180-220bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阳性；当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为270-320bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为90-120bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阴性。当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为180-220bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阴性。当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为270-320bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性。当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效。当阳性对照无条带时，表明试剂盒中有相关试剂降解，试剂盒失效。实施例2：同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测引物、试剂盒及检测方法作进一步的效果检测。一、敏感性实验将上述人工合成的阳性质控品进行稀释，依次稀释为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝μL，分别作为多重PCR模板进行敏感性实验。结果见图2-5。图1为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验结果图。其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1-10为阳性标准品从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝μL，11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约100bp清晰的PCR扩增条带，对虾肝胰腺细小病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL。图2为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的敏感性实验结果图。其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1-10为阳性标准品从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝μL，11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约196bp清晰的PCR扩增条带，斑节对虾杆状病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL。图3为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的敏感性实验结果图，其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1-10为阳性标准品从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝μL，11为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约294bp清晰的PCR扩增条带，传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL。图4为多重PCR体系中3种对虾病毒混合检测的敏感性实验结果图，其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1-10为阳性标准品从1到10依次为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝μL，11为阴性对照。从图中可以看出，从图中可以看出，泳道1-10均有约100bp、196bp和294bp清晰的PCR扩增条带，再次证明对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒和传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL。综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒，对虾肝胰腺细小病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL；斑节对虾杆状病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL；传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1×101拷贝μL。由结果表明该多重PCR检测方法的灵敏度要高于普通PCR方法。二、特异性实验根据上述的多重PCR检测方法，分别采用对虾肝胰腺细小病毒HPV、斑节对虾杆状病毒MBV、传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV作模板以及阴性对照进行实验验证，实验结果表明，本发明试剂盒及检测方法特异性较好，未出现假阳性或假阴性，实验结果见图5-图7。图5为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的特异性实验结果图，其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1为HPV阳性标准品，2为MBV模板，3为IHHNV模板，4为纯水。采用的引物是HPV引物HPV-F和HPV-R，从图中看出，对虾肝胰腺细小病毒为阳性，斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。图6为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的特异性实验结果图，其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1为MBV阳性标准品，2为HPV模板，3为IHHNV模板，4为纯水。采用的引物是HPV引物MBV-F和MBV-R，斑节对虾杆状病毒为阳性，对虾肝胰腺细小病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。图7为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的特异性实验结果图，其中M为TakaraDL2000DNAMarker，1为IHHNV阳性标准品，2为HPV模板，3为MBV模板，4为纯水。采用的引物是HPV引物IHHNV-F和IHHNV-R，传染性皮下及造血组织坏死病毒为阳性，对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒具有较好的特异性。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。SEQUENCELISTING国家海洋局第三海洋研究所一种同时检测对虾HPV、MBV和IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途P133339PatentInversion3.3122DNA人工合成1caattagaacgcatagaaaacg22220DNA人工合成2ccgcacttacctcttgtctc20321DNA人工合成3gcaagaccctctaccgatatg21422DNA人工合成4aaggagtgcagatcttgaaaat22522DNA人工合成5acagcagcaaactatgaagacc22620DNA人工合成6gcagccaagtttaagttcgt207287DNA人工合成7caattagaacgcatagaaaacgctaagaaatacatagaagaagttatagaagaaactaat60caagagttagaaaatcaagagagacaagaggtaagtgcggcggaggcagatacgatgaac120actgaagcacctgtcccgatggaaacttctgaatcagggactaccgccgcaccgcagcag180cgagctgcagcgggcggtggcggtagtggaggtggaggcgaatcagcagggtacgggaga240aactctagcgattcattccagcgccaccgcaacaaacctatcgatct2878248DNA人工合成8accataagctagcatacgtccttttgaatttttatactgttctatgcattttgcaagacc60ctctaccgatatggtatcaatgtctggagttatattattttttatataattgagtgtttt120ttgctgaccttttgaaattgcatttttatagataaataaagaatcatcgagatccttcat180ttataattgtctttatctttttgtatagcgtgttaacgctataaagattttcaagatctg240cactcctt2489428DNA人工合成9tcacatttacagacaccccatatttagaaatatttaaggatactactggactacataatc60aactatcaactaaggaagccgacgtaacattggcaaaatggatacaaaatccccaacttg120tgaccgtacaatcaacagcagcaaactatgaagacccaatccaacaatttggattcatgg180aacaaatgcgaaccggtgacagaaaagcctatacaatccatggtgacactagaaattggt240atggcggagaaataccaacaaccggacccaccttcatcccaaaatggggtggtcaattaa300aatgggacaaaccatcccttggaaacctagtctacccagcagaccaccatacaaacgact360ggcaacagatcttcatgagaatgtcaccaatcaaaggaccaaatggagacgaacttaaac420ttggctgc428

权利要求：1.一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分别为HPV-F和HPV-R、MBV-F和MBV-R、IHHNV-F和IHHNV-R，序列如SEQIDNO:1和2，SEQIDNO:3和4，SEQIDNO:5和6所示。2.一种用于同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。

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