申请/专利权人：甘肃农业大学

申请日：2017-08-01

公开（公告）日：2017-12-08

公开（公告）号：CN107447003A

主分类号：C12Q1/68(2006.01)I

分类号：C12Q1/68(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.06.28#未缴年费专利权终止;2021.02.26#授权;2018.01.05#实质审查的生效;2017.12.08#公开

摘要：本发明公开了一种检测DGAT1基因突变的PCR‑SSCP引物对，所述PCR‑SSCP引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2；并提供了其在牦牛乳品质预测和鉴别中的应用及鉴定方法和相应的试剂盒。本发明的有益效果为：本发明是根据普通牛DGAT1基因“第15内含子‑第17外显子”区序列设计了一对引物，对牦牛基因组DNA进行PCR扩增后进行SSCP分型筛选检测，通过分析带型确定牦牛DGAT1基因型和等位基因，通过等位基因序列比对确定SNPs突变，并分析DGAT1基因突变对乳脂率的影响，从而预测该牛的乳脂率高低，其优点是反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，可进行快速检测。

主权项：一种检测DGAT1基因突变的PCR‑SSCP引物对，其特征在于，所述PCR‑SSCP引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2。

全文数据：一种检测DGAT1基因突变的PCR-SSCP引物及其在牦牛乳品质鉴别方法中的应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测DGATl基因突变的PCR-SSCP引物及其在牦牛乳品质预测和鉴别方法中的应用。背景技术[0002]牦牛分布在青藏高原及其周边高寒牧区，为当地牧民提供肉、乳和毛绒等高原特色畜产品，是当地重要的生产和生活资源。牦牛乳营养丰富，风味独特，是加工高原特色乳产品的主要原料乳。牦牛乳中乳脂率、乳蛋白率和总固体物质含量分别为5.45%〜7.22%、4.86%〜5.40%、16.91%〜17.40%，均高于荷斯坦牛乳。[0003]乳脂是乳的重要组成部分，乳脂肪中甘油三酯95%以上，其合成受甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT、1_酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶6AGPAT6、磷脂酸磷酸酯酶ILPINl、二酰基甘油酰基转移酶DGAT等作用，其中DGAT是甘油三酯合成最后一步反应的关键酶。DGAT基因包括DGATl和DGAT2两种属于不同基因家族的基因。DGATl基因属酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶acyICoA:cholesterolacyltransferase,ACAT基因家族，参与脂肪合成、储存及脂蛋白组装等过程，是影响乳品质性状的重要功能候选基因。牛DGATl基因位于14号染色体，由17个外显子和16个内含子组成，编码489个氨基酸。牛DGATl基因第8外显子AA—CG的双碱基突变导致232位的赖氨酸残基突变为中性疏水性的丙氨酸残基，命名为K232A。研究表明，K基因能增加荷斯坦奶牛乳脂率、乳蛋白率及乳脂量，而A基因对提高产乳量和乳蛋白量有作用;DGATl基因启动子区及其他区域突变对产乳性状也有一定影响。另外，DGATl基因突变也影响肉牛肌内脂肪含量及猪的脂肪沉积和背膘厚。[0004]高乳脂率是牦牛乳的主要特征，近年来对牦牛乳蛋白的分子遗传报道较多，但对其乳脂性状的遗传机制研究较少。发明内容[0005]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种检测DGATl基因突变的PCR-SSCP引物及其在牦牛乳品质预测和鉴别方法中的应用。[0006]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种检测DGATl基因突变的PCR-SSCP引物对，所述PCR-SSCP引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.2。[0007]本发明的第二个目的是提供了上述PCR-SSCP引物对在检测DGATl基因突变中的应用。[0008]本发明的第三个目的是提供了上述PCR-SSCP引物对在牦牛乳品质预测和鉴别中的应用。[0009]本发明的第四个目的是提供了一种用于预示牦牛乳品质的PCR-SSCP检测试剂盒，所述试剂盒中包括有PCR-SSCP引物对的正向引物、反向引物、牦牛DGATI*A的DNA标准样和牦牛DGAT1*B的标准样，所述PCR-SSCP引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.2;所述牦牛DGAT1*A的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.3,牦牛DGAT1*B的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.4。[0010]本发明的第五个目的是提供了一种牦牛乳品质的鉴别方法，包括以下步骤：[0011]1米集样品和提取DNA;[0012]2待测样本DNA的PCR扩增，所用引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.2;[0013]3SSCP电泳:将牦牛DGAT1*A和DGAT1*B的DNA标准样和待测样本DNA同时进行SSCP电泳，牦牛DGAT1*A的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQID勵.3，牦牛06411吨的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.4;电泳结束后染色判定基因型，分别比较携带DGAT1*A等位基因待测样本和携带DGAT1*B等位基因待测样本的乳脂率、乳蛋白率、总固体物质百分含量和无脂固体物质百分含量。[0014]进一步的，上述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，所述步骤2中的PCR扩增体系如下：总体积20yL，其中DNA模板0.8yL，正、反向引物各0.8yL，TaKaRaPremixTaq聚合酶10μL，灭菌超纯水7.6yL。[0015]进一步的，上述的一种牦牛乳品种的鉴别方法，所述步骤2中，PCR扩增时的反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环;最后72°C延伸5min〇[0016]进一步的，上述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，所述步骤3中PCR产物的SSCP电泳检测过程为：取PCR扩增产物2yL于灭菌离心管中，加入8yL变性上样缓冲液，98°C变性IOmin，迅速冰浴5min后，上样到12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，290V电压、电泳室温度19〜25°C、电泳槽水循环温度22°C，进行电泳20h，银染法显色后判定基因型。[0017]进一步的，上述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，所述变性上样缓冲液的组成为：98%的去离子甲酰胺、0.025%的二甲苯氰、0.025%的溴酚蓝、10111111〇11^细0了六，变性上样缓冲液的pH值为8.0。[0018]进一步的，上述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，所述的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，Acr:Bis为37.5:1。[0019]本发明的有益效果为:本发明提供的一种检测DGAT1基因突变的PCR-SSCP引物及其在牦牛乳品质预测和鉴别方法中的应用，根据普通牛DGATl基因“第15内含子-第17外显子”区序列设计了一对引物，对牦牛基因组DNA进行PCR扩增后进行SSCP分型筛选检测，通过分析带型确定牦牛DGATl基因型和等位基因，通过等位基因序列比对确定SNPs突变，并分析DGATl基因突变对乳脂率的影响，从而预测该牛的乳脂率高低，其优点是反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，可进行快速检测。附图说明[0020]图1显示为本发明的牦牛乳品质性状候选基因DGATl的等位基因SSCP带型图。具体实施方式[0021]以甘南牦牛DGATl基因分型及乳脂率预测技术的建立为例，对本发明内容进行详细的说明。[0022]实施例1:[0023]设计牦牛乳品质性状候选基因DGATl的PCR-SSCP检测引物，具体为：[0026]引物由北京六合华大基因公司合成。[0027]实施例2:[0028]制备牦牛乳品质性状候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒：[0029]牦牛乳品质性状候选基因DGATl的PCR-SSCP检测试剂盒包括PCR反应液，DGAT1*A的DNA标准样;去离子水，10%过硫酸铵，上样变性缓冲液，TEMED四甲基乙二胺），12%非变性聚丙稀酰胺凝胶Acr:Bis=37.5:1;[0030]其中，上样变性缓冲液包括98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯氛、10mmolLEDTA，pH8·0;[0031]PCR反应的反应液：总体积20yL，其中DNA模板0.8yL，上、下游引物各0.8yL，TaKaRaPremixTaq聚合酶10yL，灭菌超纯水7·6yL。[0032]DGAT1*A的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO.3:[0034]实施例3:[0035]应用本发明的试剂盒检测牦牛乳品质性状候选基因的方法：[0036]1样品米集:耗牛颈静脉米血10ml，ACD抗凝，_70°C冻存；[0037]2基因组DNA的提取:用苯酚-氯仿法从冻存血样中提取基因组DNA;[0038]3聚合酶链式反应：[0039]PCR反应体系：总体积20yL，其中DNA模板0.8yL，上、下游引物各0.8yL，TaKaRaPremixTaq聚合酶IOyL，灭菌超纯水7.6yL;反应条件:94°C预变性5min;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环;最后72°C延伸5min;[0040]引物序列为：[0043]⑷PCR产物的SSCP检测：[0044]取PCR扩增产物2yL灭菌离心管中，加入8yL变性上样缓冲液98%去离子甲酰胺、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚蓝、lOmmolLEDTApH8.0，98°C变性lOmin，迅速冰浴5min后，上样到12%非变性聚丙烯酰胺凝胶Acr:Bis=37.5:1，290V电压、电泳室温度19〜25°C、电泳槽水循环温度22°C电泳20h，银染法显色后判定基因型。[0045]5结果判断：[0046]通过对牦牛DGATl基因“第15内含子-第17外显子”区的PCR-SSCP检测，发现有3个等位基因，能显著提高牦牛乳脂率的等位基因为DGAT1*A和DGAT1*C，能显著降低牦牛乳脂率的等位基因为DGATI*B。[0047]显著提改善牦牛乳品质的等位基因为DGAT1*A的核苷酸序列为序列表中SEQID[0048]显著降低牦牛乳品质的等位基因为DGAT1*B的核苷酸序列为（序列表中SEQID[0049]显著提高牦牛乳脂率的等位基因为DGAT1*C的核苷酸序列为（序列表中SEQID[0050]实施例4:[0051]本发明的试剂盒的使用方法：[0052]步骤如下：[0053]总体积20yL，其中DNA模板0.8yL，上、下游引物各0.8yL，TaKaRaPremixTaq聚合酶10yL，灭菌超纯水7.6yL;反应条件:94°C预变性5min;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环;最后72°C延伸5min;[0054]㈧将待检牦牛基因组DNA0.8yL50ngAxL与试剂盒中的PCR扩增液混合进行PCR反应，反应条件：94°C预变性5min;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸5min;[0055]⑶用步骤㈧中扩增的产物和DGAT1*A的DNA标准样同时与试剂盒中SSCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；[0056]C步骤⑶中检测到的带型中，携带DGAT1*A、DGAT1*B和DGAT1*C标准样带型的样品即为携带影响牦牛乳脂率等位基因的个体。[0057]实施例5:[0058]应用实施例：[0059]一、检测牦牛群体：[0060]甘南牦牛母牛249头，颈静脉采集血样IOml，血样ACD酸性柠檬酸葡萄糖抗凝；同时测定对应采集血样母牦牛的乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、总固体物质百分含量、无脂固体物质百分含量，记录其产犊时间、年龄和胎次。[0061]二、试验方法：[0062]1·引物设计和PCR扩增：[0063]引物序列如下：[0066]最佳反应体系及反应条件：[0067]PCR反应体系：总体积20yL，其中DNA模板0.8yL，上、下游引物各0.8yL，TaKaRaPremixTaq聚合酶10yL，灭菌超纯水7.6yL;反应条件:94°C预变性5min;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸5min。反应结束后，取5个PCR反应液5μL用1%琼脂糖凝胶电泳，检测是否扩增到PCR产物。[0068]2·SSCP检测：[0069]取步骤1中PCR扩增产物2yL灭菌离心管中，加入8yL变性上样缓冲液98%去离子甲酰胺、0.025%二甲苯氰、0.025%溴酚蓝、lOmmolLEDTApH8.0，98°C变性lOmin，迅速冰浴5min后，上样到12%非变性聚丙烯酰胺凝胶Acr:Bis=37.5:1，290V电压、电泳室温度19〜25°C、电泳槽水循环温度22°C电泳20h，银染法显色后判定基因型。在249头甘南牦牛中检测到六六、88^8、8：和405种330?带型，对应3种等位基因0641'1*4、*8、*：。330?电泳图如图1所示。[0070]3.基因测序：[0071]根据SSCP胶图判型结果，等位基因DGAT1*A、有纯合型个体，应用其PCR产物直接测序;等位基因DGAT1*C仅存在于杂合个体中，对特异性SSCP条带切胶、重新扩增后测序。等位基因序列由北京六合华大基因公司测定。测定结果通过DNAMAN软件进行序列比对。各等位基因核苷酸序列参见序列表中各序列。[0072]4.牦牛DGATl基因“第15内含子-第17外显子”区等位基因与乳品质性状相关性分析：[0073]本实施例运用等位基因“缺失存在”的方法，分析了甘南DGATl基因“第15内含子-第17外显子”区等位基因对乳品质性状的影响表1，结果表明携带等位基因A的牦牛个体乳脂率、乳蛋白率、总固体物质百分含量及无脂固体物质百分含量显著高于未携带者P〈0.05，携带等位基因C的个体乳脂率显著高于P〈0.05未携带者，携带等位基因B的个体乳脂率、总固体物质百分含量显著低于P〈〇.05未携带者。选留携带等位基因A的个体能改善后代牦牛群体的乳品质，选留携带等位基因C的个体，能提高后代牦牛群体的乳脂率。表IBP显示为牦牛DGATl基因“第15内含子-第17外显子”区等位基因与乳品质性状相关性分析。[0074]表1[0075][0076]其中，（P〈0.01表示差异极显著；（P〈0.05表示差异显著。[0077]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种检测DGATl基因突变的PCR-SSCP引物对，其特征在于，所述PCR-SSCP引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDΝ0·2〇2.权利要求1所述的PCR-SSCP引物对在检测DGAT1基因突变中的应用。3.权利要求1所述的PCR-SSCP引物对在牦牛乳品质预测和鉴别中的应用。4.一种用于预示牦牛乳品质的PCR-SSCP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括有PCR-SSCP引物对的正向引物、反向引物、牦牛DGATI*Α的DNA标准样和牦牛DGATI*Β的标准样，所述PCR-SSCP引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.2;所述牦牛DGAT1*A的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.3,牦牛DGAT1*B的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.4。5.—种牦牛乳品质的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：1米集样品和提取DNA;2待测样本DNA的PCR扩增，所用引物对的正向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1，反向引物的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.2;3SSCP电泳：将牦牛DGAT1*A和DGAT1*B的DNA标准样和待测样本DNA同时进行SSCP电泳，牦牛DGAT1*A的DNA标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQID勵.3，牦牛06411祁的0·标准样的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.4;电泳结束后染色判定基因型，分别比较携带DGAT1*A等位基因待测样本和携带DGAT1*B等位基因待测样本的乳脂率、乳蛋白率、总固体物质百分含量和无脂固体物质百分含量。6.根据权利要求5所述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2中的PCR扩增体系如下：总体积20yL，其中DNA模板0.8yL，正、反向引物各0.8yL，TaKaRaPremixTaq聚合酶10yL，灭菌超纯水7·6yL。7.根据权利要求5所述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，其特征在于，所述步骤2中，PCR扩增时的反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s，62°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环;最后72°C延伸5min。8.根据权利要求5所述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，其特征在于，所述步骤3中PCR产物的SSCP电泳检测过程为：取PCR扩增产物2yL于灭菌离心管中，加入8yL变性上样缓冲液，98°C变性IOmin，迅速冰浴5min后，上样到12%非变性聚丙烯酰胺凝胶，290V电压、电泳室温度19〜25°C、电泳槽水循环温度22°C，进行电泳20h，银染法显色后判定基因型。9.根据权利要求8所述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，其特征在于，所述变性上样缓冲液的组成为：98%的去离子甲酰胺、0.025%的二甲苯氰、0.025%的溴酚蓝、IOmmo1L的EDTA，变性上样缓冲液的pH值为8.0。10.根据权利要求8所述的一种牦牛乳品质的鉴别方法，其特征在于，所述的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中，Acr=Bis为37.5:1。

百度查询： 甘肃农业大学 一种检测DGAT1基因突变的PCR‑SSCP引物及其在牦牛乳品质鉴别方法中的应用

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