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申请/专利权人：云南金碧制药有限公司

摘要：午香草培育繁殖方法涉及一种植物的培育繁殖方法，特别涉及药物的培育繁殖方法。本发明操作步骤为：a.午香草外植体消毒处理的操作方法；b.无菌超净工作台的操作方法；c.培育薄壁细胞；d.午香草外植体愈伤组织增殖培养；e.午香草茎叶分化苗培养；f.午香草生根培养；g.炼苗移栽。本发明经多次试验育苗成功率和移栽后的成活率均在90％以上，实现了稳定的培育繁殖午香草，达到了投资少，经济效益高的目的；解决了午香草产种子少繁殖速度慢，面临绝种的危险。

主权项：午香草培育繁殖方法，其特征在于，其操作步骤为：a.午香草外植体消毒处理的操作方法：在晴天下午，切取午香草幼嫩叶片后，先用毛笔、牙刷、手术剪等工具轻轻清除幼叶表面的杂物，放于饱和洗衣粉液中浸泡5min，再放到清洁干净的自来水中小水冲洗30min之后用蒸馏水漂洗5次，然后移入无菌的超净工作台；b.无菌超净工作台的操作方法：先用75％的酒精浸泡10‑20s，再用0.1‑0.2％的升汞HgCl2浸泡消毒3‑6min，然后用无菌水冲洗5‑10次之后，再用无菌滤纸吸干幼叶表面水分，用无菌剪刀剪成长、宽约0.5‑1.0厘米，叶片面积约1平方厘米左右，最后用无菌接种工具在超净工作台内接种到愈伤诱导的培养基中培养；c.步骤b所述的午香草愈伤组织，是在无菌条件下，将午香草的幼叶、嫩茎等器官或组织的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，使这些器官或组织进行细胞分裂，形成一团薄壁细胞；d.午香草外植体愈伤组织增殖培养，将步骤c诱导出的愈伤中组织切割成黄豆粒大小，置于午香草外植体愈伤组织增殖的培养基中，每天光照24小时，光照强度为2500LX，培养温度25±2℃，接种20—50天后开如长出午香草愈伤组织细胞团；e.午香草茎叶分化苗培养，把午香草愈伤组织细胞团分别接种到以MS为基本培养基，并添加浓度配比为0.2‑2.0的6‑BA，0.1‑0.5的IAA、0.2—1.0的NAA、3.0％的蔗糖、6gL的琼脂、pH值5.5的经消毒灭菌的培养基中进行茎叶分化培养，约30‑50天后愈伤组织分化出丛生芽，将带有丛生芽的愈伤组织材料切成带有3‑5个丛生芽的芽块放到增殖培养基中，每瓶转接3块，培养40‑60天、当丛生芽苗长到2‑5cm时即可转入生根培养基中培养；f.午香草生根培养，当丛生芽苗长到高2‑5cm时，将其剪下转入12MS为基本培养基中，并添加浓度配比为0.05的6‑BA，0.5的NAA，20％的蔗糖，6gL的琼脂，pH值5.5的生根培养基中，6‑10天开始长根，25‑30天即长成2‑3cm高的带根苗，经过40—50天即长出完整的3—5条根系；g.炼苗移栽，将步骤f所得的培养带根苗置于常温下存放5—7天，然后揭去瓶盖，炼苗3‑4天后取出幼苗、洗净根部的培养基，再按10cmⅹ30cm的株行距把幼苗移栽入蛭石等苗床中，并用塑料薄膜覆盖保持温度和湿度，经7‑10天苗成活后去掉薄膜进行正常的土肥水管理，其成活率可达90％以上。

全文数据：午香草培育繁殖方法技术领域[0001] 本发明涉及一种植物的培育繁殖方法，特别涉及药物的培育繁殖方法。背景技术[0002]午香草 AnaphalisbulleyanaJ.F.Jaffr.Chang[PlucheabulIeayanaJ.F.Jeffr.]，也称:香附草、野辣烟、五香草，彝族人叫“窝蛸诗”，为菊科香青属植物毡毛香青的全草，性味辛、温，入胃、肺经，具有清热利湿、止咳、截疟、消炎止痛、健胃行气之功效，主治咽炎、风热感冒、扁桃体炎，支气管炎，急性肠胃炎，尿路感染，膀胱炎，尿道炎，气管炎，百日咳，小儿疳积，疟疾等常见疾病，不仅在传统中药汤剂中广泛使用，还是许多治疗咽炎、扁桃体炎、感冒、疳积等常见病中成药的重要原料，是彝族常用中药，收录于《云南中草药》、《滇南本草》及《云南省药品标准》彝族药。也是彝药“咽舒胶囊”、“咽舒□服液”的主要原料药。[0003] 午香草主要分布于大姚县的三台、铁锁、三岔河、石羊的高山阴湿水沟、箐边、草坡地及低山草地，为彝族习惯性常用药，民间用量较大，但由于近几年来连年干旱，野生午香草已濒临灭绝，并且，在所有的文献和网站上都找不到有关:彝药午香草组织培养繁殖的任何技术，生产上也没有哪个单位进行彝药午香草组织培养繁殖生产。发明内容[0004] 本发明的目的旨在于克服现有技术的缺陷，提供一种繁殖速度快、投资小解决药用植物濒危的难题，且保证药品资源的午香草培育繁殖方法。[0005] 本发明所述的午香草培育繁殖方法，其步骤为:[0006] a.午香草外植体消毒处理的操作方法:在晴天下午，切取午香草幼嫩叶片后，先用毛笔、牙刷、手术剪等工具轻轻清除幼叶表面的杂物，放于饱和洗衣粉液中浸泡5min，再放到清洁干净的自来水中小水冲洗30min之后用蒸馏水漂洗5次，然后移入无菌的超净工作台；[0007] b.无菌超净工作台的操作方法:先用75%的酒精浸泡10-20s，再用0.1-0.2%的升汞HgC12浸泡消毒3-6min，然后用无菌水冲洗5-10次之后，再用无菌滤纸吸干幼叶表面水分，用无菌剪刀剪成长、宽约0.5-1.0厘米，叶片面积约I平方厘米左右，最后用无菌接种工具在超净工作台内接种到愈伤诱导的培养基中培养；[0008] c.步骤b所述的午香草愈伤组织，是在无菌条件下，将午香草的幼叶、嫩茎等器官或组织的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，使这些器官或组织进行细胞分裂，形成一团薄壁细胞；[0009] d.午香草外植体愈伤组织增殖培养，将步骤c诱导出的愈伤中组织切割成黄豆粒大小，置于午香草外植体愈伤组织增殖的培养基中，每天光照24小时，光照强度为2500LX，培养温度25±2°C，接种20—50天后开如长出午香草愈伤组织细胞团；[0010] e.午香草茎叶分化苗培养，把午香草愈伤组织细胞团分别接种到以MS为基本培养基，并添加浓度配比为0.2-2.0的6-8厶，0.1-0.5的1厶厶、0.2—1.0的熟厶、3.0%的蔗糖、681的琼脂、pH值5.5的经消毒灭菌的培养基中进行茎叶分化培养，约30-50天后愈伤组织分化出丛生芽，将带有丛生芽的愈伤组织材料切成带有3-5个丛生芽的芽块放到增殖培养基中，每瓶转接3块，培养40-60天、当丛生芽苗长到2-5cm时即可转入生根培养基中培养；[0011] f.午香草生根培养，当丛生芽苗长到高2-5cm时，将其剪下转入12MS为基本培养基中，并添加浓度配比为0.05的6-BA，0.5的NAA，20%的蔗糖，6gL的琼脂，pH值5.5的生根培养基中，6-10天开始长根，25-30天即长成2-3cm高的带根苗，经过40—50天即长出完整的3一5条根系；[0012] g.炼苗移栽，将步骤f所得的培养带根苗置于常温下存放5—7天，然后揭去瓶盖，炼苗3-4天后取出幼苗、洗净根部的培养基，再按1cmx30cm的株行距把幼苗移栽入蛭石等苗床中，并用塑料薄膜覆盖保持温度和湿度，经7-10天苗成活后去掉薄膜进行正常的土肥水管理，其成活率可达90%以上。[0013] 步骤c所述的午香草外植体愈伤诱导培养基，其配方为以MS为基本培养基，加入浓度配比为2.0的2，4-D，0.2的6-BA，1.0gL的PVP，5gL的蔗糖，7gL的琼脂，其PH=5.8。[0014] 步骤d所述的午香草外植体愈伤组织增殖培养基，其配方为以12MS为基本培养基，并加入浓度比为1.0的2，4-0，0.2的6-8厶，1.^1的?¥?，蔗糖1581，琼脂781，？!1=5.8。[0015] 步骤g所述的炼苗移栽，在幼苗的生长期间用15MS大量元素的水溶液作追肥。[0016] 本发明所述的午香草培育繁殖方法，午香草的全株为黄色，植株高可达100cm，被白色绵毛;茎圆柱形，在茎杆上有明显的纵皱纹，茎杆上端多分枝。茎杆粗直径2-8mm、质脆容易折断、断面呈黄绿色、中心有白瓤。单叶、互生、莲座状、全缘、倒卵形或倒披针形，沿茎下延成楔形宽翅，先端尖，边缘平，两面有腺毛。最上部叶狭小、线状披针形、叶脉上密被白色长绵毛;花白色，头状花序，气清香，味苦凉。显微鉴别特征:薄壁细胞类圆形或多角形;油细胞类圆形;导管网纹和孔纹，直径7_30μπι;纤维梭状;气孔平轴式;腺毛多、多节。因为午香草全株被丝状白色棉毛、棉毛长可达10cm，同时植株还长有锈褐色粘质带柄的多节腺毛，带有大量的杂菌，导致外植体极易污染，其控制污染的操作程序是:外植体一一叶片一一用毛笔刷去杂物——饱和洗衣粉液浸泡5mim——清洁干净的自来水冲洗30min——蒸馏水漂洗5次一一移入超净工作台一一消毒选用75%的酒精处理10-15S—无菌水漂洗5次—0.1%的HgCl2滴加吐温-80，每升加20滴3-5min—无菌水洗8-10次，可控制外植体的污染率。[0017]因此，午香草外植体消毒方法技术体系，午香草外植体消毒处理的操作方法:在晴天下午，切取午香草幼嫩叶片后，先用毛笔、牙刷、手术剪等工具轻轻清除幼叶表面的杂物，放于饱和洗衣粉液中浸泡5min，再放到清洁干净的自来水中小水冲洗30min之后用蒸馈水漂洗5次，然后移入无菌的超净工作台中完成全部操作程序:先用75%的酒精浸泡10-20S，再用0.1-0.2%的升萊HgCl2浸泡消毒3-6min，然后用无菌水冲洗5-10次之后，再用无菌滤纸吸干幼叶表面水分，用无菌剪刀剪成长、宽约0.5-1.0厘米，叶片面积约I平方厘米左右，最后用无菌接种工具在超净工作台内接种到愈伤诱导的培养基中培养，诱导午香草外植体愈伤组织。[0018] 完成午香草外植体愈伤诱导培养基配方筛选，午香草愈伤组织是在无菌条件下，将午香草的幼叶、嫩茎等器官或组织的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成的一团薄壁细胞。它在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株，它是午香草快速繁殖的基础。[0019]由于午香草全株被蛛丝状白色绵毛、体表带有大量的腺体，内含锈褐色粘质汁液，既带有大量杂菌、容易引起污染，又容易产生褐变、导致愈伤组织和外植体褐化，同时对植物生长调节剂极为敏感，且国内外暂无午香草快繁技术的研究技术可供参考，加大了午香草组织培养的难度。[0020] 研究人员先后以12MS、MS、B5、N6培养基为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、Kt、2，4—D、IBA、IAA、NAA、PVP、活性炭、蔗糖、琼脂等组合配比，从121个培养基配方中筛选出午香草外植体愈伤诱导培养基配方，经过30天左右即可培养出大量的愈伤组织。其配方如下:[0021] MS+2，4-D2.0+6-BA0.2+PVPI.0gL+蔗糖15gL+琼脂7gLPH=5.8[0022] 完成午香草外植体愈伤组织增殖培养基配方筛选，将诱导出的愈伤组织切割成黄豆粒大小，分别接种到以12MS、MS、B5、N6培养基为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、Kt、2，4一0、184、14444六、？¥?、活性炭、蔗糖、琼脂等组合配比，从80个培养基配方中筛选出午香草外植体愈伤组织增殖的培养基配方:l2MS+2，4-D1.0+6-BA0.2+PVP1.0gL+蔗糖15gL+琼脂7gLPH=5.8，每天光照24小时，光照强度为2500LX，培养温度25±2°C，接种20一一50天后开如长出大量的午香草愈伤组织细胞团，从而实现愈伤增殖。[0023] 完成午香草茎叶分化苗培养基配方筛选，把午香草愈伤组织细胞团分别接种到:MS为基本培养基，添加不同浓度配比的6-BA0.2-2.0,IAA0.1-0.5,NAA0.2—1.0、蔗糖3.0%、琼脂6gL、pH值5.5的事先配制消毒灭菌的培养基中进行培养中进行茎叶分化培养，约30-50d后愈伤组织分化出丛生芽。将带有丛生芽的愈伤组织材料切成带有3-5个丛生芽的芽块放到增殖培养基中，每瓶转接3块，培养40-60d、当丛生芽苗长到2-5cm时即可转入生根培养基中培养。[0024] 完成午香草生根培养研究，当继代培养苗高2_5cm时，将其剪下转入12MS基本培养基中，添加6-BA0.05+NAA0.5+20%蔗糖+琼脂6gL，pH值5.5。一般6_10d开始长根，30d左右即可长成2_3cm尚的带根苗，经过40—50d即能长出完整的3—5条根系。[0025] 炼苗移栽技术，将培养带根苗置于常温下存放5—7d，然后揭去瓶盖，炼苗3-4d后取出幼苗、洗净根部的培养基，再按1cmx30cm的株行距把幼苗移栽入蛭石等苗床中，并用塑料薄膜覆盖保持温度和湿度，经7-10d苗成活后去掉薄膜进行正常的土肥水管理，其成活率可达90%以上。生长期间可用I5MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长。[0026] 本发明所述的午香草培育繁殖方法，经多次试验探索，已经探索出午香草的组织培养试管苗和相关技术体系，实现了午香草种苗繁殖不受地区和季节限制，经多次培育、栽培，育苗成功率和移栽后的成活率均在90%以上，实现了稳定的培育繁殖午香草，达到了投资少，经济效益高的目的;解决了午香草产种子少繁殖速度慢，面临绝种的危险。具体实施方式[0027]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于实施例。[0028] 实施例1[0029] 1、控制午香草外植体污染方法[0030] 控制污染的操作程序是:外植体--叶片--用毛笔刷去杂物--饱和洗衣粉液浸泡5mim——清洁干净的自来水冲洗30min——蒸馏水漂洗5次——移入超净工作台——消毒选用75%的酒精处理10-15s—无菌水漂洗5次—0.1%的HgC12滴加吐温-80，每升加20滴3-5min—无菌水洗8-10次，可控制外植体的污染率。[0031] 2、午香草外植体消毒方法技术体系[0032] 午香草外植体消毒处理的操作方法:在晴天下午，切取午香草幼嫩叶片后，先用毛笔、牙刷、手术剪等工具轻轻清除幼叶表面的杂物，放于饱和洗衣粉液中浸泡5min，再放到清洁干净的自来水中小水冲洗30min之后用蒸馏水漂洗5次，然后移入无菌的超净工作台中完成全部操作程序:先用75%的酒精浸泡10-20S，再用0.1-0.2%的升汞取:12浸泡消毒3-6min，然后用无菌水冲洗5_10次之后，再用无菌滤纸吸干幼叶表面水分，用无菌剪刀剪成长、宽约0.5-1.0厘米，叶片面积约I平方厘米左右，最后用无菌接种工具在超净工作台内接种到愈伤诱导的培养基中培养，诱导午香草外植体愈伤组织。[0033] 3、午香草外植体愈伤诱导培养基配方[0034] MS+2，4-D2.0+6-BA0.2+PVPI.0gL+蔗糖15gL+琼脂7gLPH=5.8[0035] 4、完成午香草外植体愈伤组织增殖培养基配方[0036] 将诱导出的愈伤组织切割成黄豆粒大小，接种于l2MS+2，4-D1.0+6-BA0.2+PVP1.0gL+蔗糖15gL+琼脂7gLPH=5.8，每天光照24小时，光照强度为2500LX，培养温度25±2°C，接种20—一50天后开如长出大量的午香草愈伤组织细胞团，从而实现愈伤增殖。[0037] 5、完成午香草茎叶分化苗培养基配方筛选[0038] 把午香草愈伤组织细胞团分别接种到:MS为基本培养基，添加不同浓度配比的6-BA0.2-2.0,IAA0.1-0.5、NAA0.2—1.0、蔗糖3.0%、琼脂6gL、pH值5.5的事先配制消毒灭菌的培养基中进行培养中进行茎叶分化培养，约30-50d后愈伤组织分化出丛生芽。将带有丛生芽的愈伤组织材料切成带有3-5个丛生芽的芽块放到增殖培养基中，每瓶转接3块，培养40-60d、当丛生芽苗长到2-5cm时即可转入生根培养基中培养。[0039] 6、完成午香草生根培养研究[0040] 当继代培养苗高2-5cm时，将其剪下转入12MS基本培养基中，添加6-BA0.05+NAA0.5+20%蔗糖+琼脂6gL，pH值5.5。一般6_10d开始长根，30d左右即可长成2-3cm高的带根苗，经过40—50dS卩能长出完整的3—5条根系。[0041] 7、炼苗移栽技术[0042] 将培养带根苗置于常温下存放5—7d，然后揭去瓶盖，炼苗3-4d后取出幼苗、洗净根部的培养基，再按1cmx30cm的株行距把幼苗移栽入蛭石等苗床中，并用塑料薄膜覆盖保持温度和湿度，经7-10d苗成活后去掉薄膜进行正常的土肥水管理，其成活率可达90%以上。

权利要求：1.午香草培育繁殖方法，其特征在于，其操作步骤为:a.午香草外植体消毒处理的操作方法:在晴天下午，切取午香草幼嫩叶片后，先用毛笔、牙刷、手术剪等工具轻轻清除幼叶表面的杂物，放于饱和洗衣粉液中浸泡5min，再放到清洁干净的自来水中小水冲洗30min之后用蒸馏水漂洗5次，然后移入无菌的超净工作台；b.无菌超净工作台的操作方法:先用75 %的酒精浸泡10-20s，再用0.1-0.2%的升汞HgC12浸泡消毒3-6min，然后用无菌水冲洗5-10次之后，再用无菌滤纸吸干幼叶表面水分，用无菌剪刀剪成长、宽约0.5-1.0厘米，叶片面积约I平方厘米左右，最后用无菌接种工具在超净工作台内接种到愈伤诱导的培养基中培养；c.步骤b所述的午香草愈伤组织，是在无菌条件下，将午香草的幼叶、嫩茎等器官或组织的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，使这些器官或组织进行细胞分裂，形成一团薄壁细胞；d.午香草外植体愈伤组织增殖培养，将步骤C诱导出的愈伤中组织切割成黄豆粒大小，置于午香草外植体愈伤组织增殖的培养基中，每天光照24小时，光照强度为2500LX，培养温度25±2°C，接种20—50天后开如长出午香草愈伤组织细胞团；e.午香草茎叶分化苗培养，把午香草愈伤组织细胞团分别接种到以MS为基本培养基，并添加浓度配比为0.2-2.0的6-84，0.1-0.5的144、0.2—1.0的熟六、3.0%的蔗糖、681的琼月旨、PH值5.5的经消毒灭菌的培养基中进行茎叶分化培养，约30-50天后愈伤组织分化出丛生芽，将带有丛生芽的愈伤组织材料切成带有3-5个丛生芽的芽块放到增殖培养基中，每瓶转接3块，培养40-60天、当丛生芽苗长到2-5cm时即可转入生根培养基中培养；f.午香草生根培养，当丛生芽苗长到高2-5cm时，将其剪下转入12MS为基本培养基中，并添加浓度配比为0.05的6-BA，0.5的NAA，20%的蔗糖，6gL的琼脂，pH值5.5的生根培养基中，6-10天开始长根，25-30天即长成2-3cm高的带根苗，经过40—50天即长出完整的3—5条根系；g.炼苗移栽，将步骤f所得的培养带根苗置于常温下存放5—7天，然后揭去瓶盖，炼苗3-4天后取出幼苗、洗净根部的培养基，再按1cmx30cm的株行距把幼苗移栽入蛭石等苗床中，并用塑料薄膜覆盖保持温度和湿度，经7-10天苗成活后去掉薄膜进行正常的土肥水管理，其成活率可达90%以上。2.根据权利要求1所述的午香草培育繁殖方法，其特征在于，步骤c所述的午香草外植体愈伤诱导培养基，其配方为以MS为基本培养基，加入浓度配比为2.0的2，4-D，0.2的6-BA，I.0gL的PVP，5gL的蔗糖，7gL的琼脂，其PH=5.8。3.根据权利要求1所述的午香草培育繁殖方法，其特征在于，步骤d所述的午香草外植体愈伤组织增殖培养基，其配方为以12MS为基本培养基，并加入浓度比为1.0的2，4-D，0.2的6-BA，I.0gL的PVP，蔗糖15gL，琼脂7gL，PH=5.8。4.根据权利要求1所述的午香草培育繁殖方法，其特征在于，步骤g所述的炼苗移栽，在幼苗的生长期间用15MS大量元素的水溶液作追肥。

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