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申请/专利权人：成都百泰赛维生物科技有限公司;庞剑会

摘要：本发明公开了一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，针对分离自汉族人的HDV病毒的检测，解决了现有技术中HDV病毒检测特异性不够高，漏检率高，假阴性高、价格昂贵，不适于汉族人的问题。本发明包括以下步骤：合成反转录引物、扩增引物组；分离获得RNA；配制反转录反应体系，进行反转录反应，获得cDNA；配制PCR扩增反应体系，进行PCR扩增反应，定性PCR检测。本发明特异性强、灵敏度高，结果准确，对人体无创，适于汉族人，且价格低廉。

主权项：一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1：合成引物，所述引物包括反转录引物和扩增引物组，所述反转录引物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1所示的序列或如SEQ ID NO:2所示的序列，所述扩增引物组的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:3所示的序列和SEQ ID NO:4所示的序列，或者如SEQ ID NO:5所示的序列和SEQ ID NO:6所示的序列。步骤2：分离获得RNA；步骤3：配制反转录反应体系，进行反转录反应，获得cDNA；步骤4：配制PCR扩增反应体系，进行PCR扩增反应，PCR检测。

全文数据：一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法。背景技术[0002]HDV病毒丁型肝炎病毒是一种缺陷的嗜肝单链RNA病毒，需要HBV病毒（乙型肝炎病毒）的辅助才能进行复制，因此HDV与HBV同时或重叠感染，HDV与HBV同时或重叠感染传染性更强。[0003]目前我国临床上对HDV没有足够认识，对HDV的检测仅限于科学研究。检测方法主要为ELISA法、ISH法和PCR法。用ELISA法检测HDV，存在HDAg抗体效价差，检测特异性不够高，漏检率高，假阴性高的缺点。ISH法为检测HDV病毒的金标准，特异好，准确率高，但采用ISH法，需要新鲜组织标本，给人造成的损伤较大，且检测周期为2天，检测时间长。PCR法检测HDV特异好，灵敏度高，所需样本量少，对人体无创。[0004]德国耶拿分析仪器股份公司的RoboGcneS.roVRNA检测试剂盒即是采用PCR法检测HDV。该试剂盒通过PCR法检测HDV，但该技术需要采用Taqman法扩增，需用专门的仪器和耗材进行检测，试剂盒中所用的探针携带荧光发光基团，需要避光操作，保存时间短，反复冻融后荧光易淬灭，检测条件严苛，检测成本高。且该试剂盒中的引物为非特异性随机引物，其序列与人的基因模板有三个位点是重合的，会对检测产生干扰，使结果有假阳性的可能;该引物序列针对的是印第安人或欧洲人，未在汉族人中验证，对于汉族人适用性差。[0005]根据核苷酸序列同源性分析，HDV共有3种亚型，I型分布最广泛在北美、欧洲、非洲、东亚、西亚和南太平洋地区；II型只分布在东亚；III型只分布在南美。国外文献报道的引物都是针对I型或者III型，因为HDV病毒高度变异，含有多个SNP位点或者突变位点，因此针对I型或者III型的引物对II性HDV病毒检测无效或者效果弱。即使同为II型检测引物，因为我国汉族II型HDV病毒与国外公布序列相比，核苷酸同源性仅为66.3%，也不适于汉族人口的HDV病毒检测。[0006]因此提供一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，特异性强、灵敏度高，结果准确，操作简单方便，检测成本低，对人体无创，适于汉族人，成为了本领域技术人员亟待解决的技术问题。发明内容[0007]本发明提供了一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，该方法特异性强、灵敏度高，结果准确，操作简单方便，检测成本低，对人体无创，适于汉族人。[0008]本发明采用的技术方案如下：[0009]本发明的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，包括以下步骤：[0010]步骤1:合成引物，所述引物包括反转录引物和扩增引物组，所述反转录引物的核苷酸序列选自如SEQIDNO:1所示的序列或如SEQIDNO:2所示的序列;所述扩增引物组的核苷酸序列选自如SEQIDNO:3所示的序列和SEQIDNO:4所示的序列，或者如SEQIDNO:5所示的序列和SEQIDNO:6所示的序列；[0011]步骤2:分离获得RNA;[0012]步骤3:配制反转录反应体系，进行反转录反应，获得cDNA;[0013]步骤4:配制PCR扩增反应体系，进行PCR扩增反应，PCR检测。[0014]优选地，所述反转录引物的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的序列，所述扩增引物组的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的序列和SEQIDNO:4所示的序列。[0015]优选地，所述反转录引物的核苷酸序列为SEQIDN0:2所示的序列，所述扩增引物组的核苷酸序列为SEQIDNO:5所示的序列和SEQIDNO:6所示的序列。[0016]进一步优选地，所述步骤1合成的所述引物的浓度均为IOpmo1μ1。[0017]更进一步优选地，所述步骤3中，所述配制反转录反应体系即将5μ1所述步骤2得到RNA液加入到反转录反应体系中，所述反转录反应体系包括以下组分：[0018][0019]所述反转录反应的条件为25°C60min，65°C5min。[0020]优选地，所述步骤4中，所述配制PCR扩增反应体系即将5μ1所述步骤3得到cDNA液加入到扩增反应体系中，所述扩增反应体系包括以下组分：[0021][0022]所述扩增反应的条件为95°C2min;95°C30s，58.3°C30s，72°CIOs，循环30次；2°C5min，4°C保存。[0023]优选地，所述步骤4中，所述PCR检测为1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。[0024]优选地，所述1.5%琼脂糖凝胶电泳检测条件为:配制0.5XTBE的电泳缓冲液，所述1.5%琼脂糖凝胶的溶液中含有万分之一体积GoldView，所述电泳条件为120V20min，取8μ1所述PCR扩增反应后的产物电泳，跑胶完成后，于紫外灯下显影。[0025]本发明所指的HDV病毒为分离自汉族人的HDV病毒。我国HDV病毒类型复杂，从大类上说有I型和II型，根据我国25省市丁肝感染的血清流行病调查，我国I型HDV病毒至少存在两个不同的基因亚型，且与国外的I型HDV病毒相比，存在多个位点的突变。其中IB代表株四川株的rHDAg的抗原反应弱，甚至不反应。汉族人口虽然存在多种不同基因亚型的HDV，但是保守区的氨基酸同源性高达89.7%，适合做鉴定。[0026]与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0027]采用本发明进行HDV病毒检测，特异性强，灵敏度高，结果准确可靠，操作简单方便，检测时间短，检测成本低，无破坏性，适于汉族人群，且廉价易得，填补了临床上无针对汉族人群HDV病毒检测的空白，适于推广应用。[0028]本发明针对汉族人群感染的HDV病毒基因的保守区设计特异性反转录引物，人基因组模板不包含该引物序列，提高了检测的特异性，检测结果不存在假阳性的可能性，且更适于汉族人群。[0029]采用本发明检测HDV病毒，与采用金标准ISH法检测的结果一致，本发明检测结果准确。采用本发明进行检测仅需30_40μ1血清或体液，无需穿刺，无破坏性;灵敏度高，检出范围在5-25IUml;检测时间为2小时，极大地缩短了检测周期。[0030]采用本发明检测HDV病毒不需避光操作，不需特殊检测仪器，使得检测成本更低，更适于推广应用。[0031]本发明使HDV病毒检测简单易行，方便快捷，结果准确可靠，填补了临床上无针对汉族人群HDV病毒检测的空白，具有极大地临床应用价值，适于推广应用。附图说明[0032]附图1为本发明的灵敏度图。具体实施方式[0033]下面结合附图说明和实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。[0034]实施例1[0035]采用本发明进行HDV病毒检测，包括以下步骤：[0036]步骤1:合成反转录引物和扩增引物组。汉族人口虽然存在多种不同基因亚型的HDV，但保守区的氨基酸同源性高达89.7%，适合做鉴定，针对保守区设计引物具有良好的特异性。根据分离自汉族人的HDV病毒基因的保守区设计的引物序列如下：[0037]反转录引物的序列为:GAGCATCCGCCCCACTTCACTC，[0038]扩增引物组的序列为:CTCCTTGCTGAGGTTCTTGC，[0039]TGGCCGGAAGAAAGAAGTTA；[0040]合成上述设计引物。[0041]步骤2:分离获得RNA;[0042]2.1外周血利用细胞分离液分离单个核细胞：[0043]1外周血送检需2ml抗凝血，常温送检；[0044]2加入等体积无菌PBS于外周血中充分混合，形成细胞悬液；[0045]3加入2ml细胞分离液于另一离心管；[0046]⑷吸取4ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到细胞分离液表面注意勿与细胞分离液混合），离心1500rpm20min;[0047]5用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清直接或加入RNA保存液混匀后直接提取RNA可以先进行细胞计数以保证细胞数）。[0048]2.2提取RNA:[0049]1先加ImlTrizol于IXIO7细胞中，若冻存细胞直接加入T试剂，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-1Omin可-70°C，1月）；[0050]2加入0.2ml氯仿三氯甲胺），剧烈震荡（vigorously15s，室温静置2-3min;[0051]3在4Γ下l，2000g离心15min;[0052]⑷小心吸出上清水相约500μ1移入另一离心管注意不要抽到蛋白层），加入500μ1异丙醇专用），颠倒混匀不要太剧烈），室温静置IOminRNA沉到底部）；[0053]54°C1，2000g离心lOmin，倒去上清液，底部可见针尖大小白色物质RNA;[0054]⑹加入Iml70%乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；[0055]74°C7500g离心5min，去除乙醇尽量用枪头吸干净后晾5-10min，不要太干，否则难以溶解。RNA可以在70%乙醇中-80°C保存1年。[0056]步骤3:配制反转录反应体系，进行反转录反应，获得cDNA:将5μ1步骤2得到RNA液加入到反转录反应体系中，反转录反应体系包括表1中的组分：[0057]表1反转录反应体系表[0058][0059]将反转录反应体系置于PCR仪中，PCR仪型号为BioRadFCX96，设置如下反应程序：251€6〇111丨11，651€5111丨11，得到〇0嫩。[0060]步骤4:配制PCR扩增反应体系，进行PCR扩增反应，定性PCR检测。[0061]将5μ1步骤3得到cDNA液加入到扩增反应体系中，扩增反应体系包括表2中的组分：[0062]表2扩增反应体系表[0063][0064]将扩增反应体系置于PCR仪中，PCR仪型号为BioRadFCX96,设置如下反应程序：[0065]l95〇C2min；[0066]295°C30s，58·3°C30s，72°CIOs，循环30次；[0067]372Γ5πΰη，4Γ保存。[0068]配0.5XTBE电泳缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶溶液中含有万分之一体积GoldView，电泳条件：120V20min，8ulPCR产物电泳。跑胶完成后，紫外灯下显影。[0069]步骤5:结果判定:在紫外灯下有280bp条带者为阳性。[0070]实施例2[0071]采用本发明进行PCR法检测HDV病毒，本实施例与实施例1相比，设计与合成的反转录引物和扩增引物组不同，其余条件同实施例1。[0072]本实施例根据分离自汉族人的HDV病毒基因的保守区设计的引物序列如下：[0073]反转录引物序列为:ACCGTGAGTTCTATTGCCCT;[0074]扩增引物组序列为:GCTGGGTTCCTCGGATGT，[0075]AGAAAGAAGAGTAGCCGGCC〇[0076]实施例3[0077]灵敏度试验[0078]用已知HDV感染的样本作为阳性样本，通过系列稀释，检测稀释后的样本的PCR扩增效果。[0079]把阳性样本按照2、4、8、16、32倍稀释，按照实施例1的方法进行册¥病毒检测，稀释后扩增效果显示最低40μ1血清即可用于检测。[0080]结果显示，本发明灵敏度高，检出范围在5-25C0pyml。[0081]实施例4[0082]对比例[0083]采用ELISA法检测检测HDV病毒，包括以下步骤：[0084]步骤1:包被：用0.05MPH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1〜10ygml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.Iml，4°C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。[0085]步骤2:加样:加一定稀释的待检样品0.Iml于上述已包被之反应孔中，置37°C孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。[0086]步骤3:加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体经滴定后的稀释度0.Iml。37°C孵育0.5〜1小时，洗涤。[0087]步骤4:加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.Iml，37°C10〜30分钟。[0088]步骤5:终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。[0089]步骤6:结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以号表示。也可测〇·D值:在ELISA检测仪上，于450nm若以ABTS显色，则410nm处，以空白对照孔调零后测各孔〇·D值，若大于规定的阴性对照㈤值的2.1倍，即为阳性。[0090]实施例5[0091]对比例[0092]采用ISH原位杂交法检测检测HDV病毒，包括以下步骤：[0093]步骤1:载玻片涂层处理（Slidecoating[0094]1将载玻片置于盐酸乙醇溶液（1%HC1in70%Ethanol中清洗；[0095]2晾干后放入poly-L-lysine0.01%溶液中5分钟；[0096]3放入60°C烘箱60分钟烘干或者放在室温过夜晾干。[0097]步骤2:样品固定（Samplefixation[0098]1在样品（肝癌新鲜组织）中加入3倍体积的4%多聚甲醛paraformaldehyde，置于4°C冰箱固定3小时以上或者过夜；[0099]2离心，弃去多聚甲醛，加入相同体积的PBS;[0100]3离心，弃去PBS，加入相同体积的乙醇+PBSww1:1;[0101]⑷固定后的样品放入_20°C冰箱保存。[0102]步骤3:脱水Dehydration[0103]1将适量固定后的样品放在载玻片上；[0104]2放入46°C烘箱烘干10分钟；[0105]3依次浸入50%，80%，96%的乙醇溶液，各3分钟；[0106]⑷在空气中晾干。[0107]步骤4:杂交Hybridization[0108]1加10微升Hybridizationbuffer配制方法见下面表格到玻璃片的样品上，尽量让样品全被覆盖；[0109]⑵在Hybridizationbuffer上加1微升探针Probe;[0110]3在50ml离心管中放一张润湿的吸水纸，将玻璃片放入，然后一起放到46°C恒温箱，杂交1.5小时；[0111]⑷将Washingbuffer配制方法见下面表格预热到48°C，准备下一步使用。[0112]步骤5:冲洗[0113]1杂交1.5小时之后，快速将玻璃片放入48°CWashingbuffer;[0114]2在48°C恒温箱中放置30min;[0115]3用超纯水润洗玻璃片，然后再空气中晾干。[0116]步骤6:镜检[0117]瞭干后，将样品用适量的antifadingreagent覆盖，盖上盖玻片，置于共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscopy下观察。[0118]实施例6:利用实施例1的方法对110位汉族人进行HDV病毒检测，结果见表1。[0119]实施例7:利用实施例2的方法对实施例6中的110位汉族人进行HDV病毒检测，结果见表3。[0120]实施例8:利用实施例4的方法对实施例6中的110位汉族人进行HDV病毒检测，结果见表3。[0121]实施例9:利用实施例5的方法对实施例6中的110位汉族人进行HDV病毒检测，结果见表3。[0122]表3不同方法检测HDV结果表[0123][0124]由表3可知，使用ELISA法对110位汉族人进行检测，仅检测出25人感染了HDV病毒，采用ISH检测到43例，采用本发明检测，分别检测到44和43例，采用本发明的检测结果与采用ISH法的结果一致。采用新鲜组织标本进行检测的ISH法为检测是否感染HDV病毒的金标准。采用ELISA法的检测结果与ISH法相比，漏检率高达76%;采用本发明的检测结果与ISH法一致，说明采用了本发明的检测结果准确，特异性好。但本发明仅需2ml外周血或体液，检测周期为4个小时，而ISH法检测需要新鲜组织标本，检测周期为2天。采用了本发明检测周期短，费用低，对人体无创伤。采用本发明检测HDV病毒不需避光操作，不需特殊检测仪器，检测成本低。[0125]上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:包括以下步骤：步骤1:合成引物，所述引物包括反转录引物和扩增引物组，所述反转录引物的核苷酸序列选自如SEQIDNO:1所示的序列或如SEQIDNO:2所示的序列，所述扩增引物组的核苷酸序列选自如SEQIDNO:3所示的序列和SEQIDNO:4所示的序列，或者如SEQIDNO:5所示的序列和SEQIDNO:6所示的序列。步骤2:分离获得RNA;步骤3:配制反转录反应体系，进行反转录反应，获得cDNA;步骤4:配制PCR扩增反应体系，进行PCR扩增反应，PCR检测。2.根据权利要求1所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:所述反转录引物的核苷酸序列为SEQIDN0:1所示的序列，所述扩增引物组的核苷酸序列为SEQIDN0:3所示的序列和SEQIDN0:4所示的序列。3.根据权利要求1所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:所述反转录引物的核苷酸序列为SEQIDN0:2所示的序列，所述扩增引物组的核苷酸序列为SEQIDN0:5所示的序列和SEQIDN0:6所示的序列。4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:所述步骤1合成的所述引物的浓度均为lOpmolμΙ。5.根据权利要求4所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:所述步骤3中，所述配制反转录反应体系即将5μ1所述步骤2得到RNA液加入到反转录反应体系中，所述反转录反应体系包括以下组分：所述反转录反应的条件为25°C60min，65°C5min。6.根据权利要求5所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:所述步骤4中，所述配制PCR扩增反应体系即将5μ1所述步骤3得到cDNA液加入到扩增反应体系中，所述扩增反应体系包括以下组分：所述扩增反应的条件为951€2111丨11;951€3〇8,58.31€3〇8,72°：1〇8，循环30次；21€51^11，4°C保存。7.根据权利要求6所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于:所述步骤4中，所述PCR检测为1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。8.根据权利要求7所述的一种PCR法检测汉族人HDV病毒的方法，其特征在于：所述1.5%琼脂糖凝胶电泳检测条件为:配制0.5XTBE的电泳缓冲液，所述1.5%琼脂糖凝胶的溶液中含有万分之一体积GoldView，所述电泳条件为120V20min，取8μ1所述PCR扩增反应后的产物电泳，跑胶完成后，于紫外灯下显影。

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