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申请/专利权人：武汉大学

摘要：本发明提供了一种抑制人SRSF3基因表达的反义寡核苷酸序列及其应用。该反义寡核苷酸序列的分子式为：5’‑GTTTCAACAAGCTAGAAATG‑3’，每个反义寡核苷酸的碱基都做了2'‑O‑Methyl和硫代修饰。本发明的反义寡核苷酸抑制SRSF3基因外显子4的外显子剪切抑制子的功能，促进了可变外显子4的剪切，进而减少了全长有功能的SRSF3蛋白的表达，抑制了口腔癌细胞的生长，具有抑制口腔癌的开发和应用前景。

主权项：1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，其分子式为：5’-GTTTCAACAAGCTAGAAATG-3’，所有碱基都经2'-O-Methyl修饰和硫代修饰。

全文数据：抑制人SRSF3基因表达的反义寡核苷酸序列及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术和医学领域。具体涉及针对癌基因SRSF3的反义寡核苷酸序列及其应用。背景技术[0002]人的基因序列包括外显子exon和内含子（intronh由RNA聚合酶根据基因模板合成前体信使RNAmRNA包括外显子和内含子。内含子必须由剪切复合体spliceosome去除并将外显子连接，才能形成成熟的mRNA，并指导蛋白质的合成。前体mRNA中内含子和外显子的剪切并不是一成不变的，可以有多种剪切方式被称为可变剪切（alternativesplicing。比如:有些外显子可能在剪切时被排除在成熟的mRNA中，称为外显子跳跃exonskipping，有些内含子被保留在成熟的mRNA中，称为内含子保留（intronretention。因此，通过可变剪切的方式，一个基因往往可以产生多种mRNA，并编码多种蛋白质。目前发现超过90%的人类基因的前体mRNA都会发生可变剪切，产生多种mRNA，极大地丰富了基因组的编码能力。[0003]很多研宄都发现可变剪切与癌症的发生发展有密切的关系。癌细胞的前体mRNA的可变剪切方式与正常细胞有显著区别\细胞中前体mRNA可变剪切的调节主要是可变剪切因子（splicingfactor〇SRSF3又称为SRp20是一个重要的可变剪切调节因子。我们在2010年发现SRSF3是一个原癌基因2。很多癌组织中都高表达SRSF3;抑制SRSF3的表达导致癌细胞生长受到明显影响，在裸鼠体内成瘤能力也明显下降;在非癌细胞中提高SRSF3的表达水平可以促进细胞生长和在裸鼠体内成瘤。抑制SRSF3的表达可以作为治疗癌症的一种方法。我们在2015年发现人的SRSF3基因有一个可变外显子4。不包含该外显子的mRNA可以编码全长的有功能的SRSF3蛋白。而包含该外显子的mRNA，由于出现了终止密码子，只能编码截短的SRSF3蛋白或经NMDnonsense-mediateddecay途径降低。因此在癌细胞中包含外显子4的mRNA很少，主要是不包括外显子4的mRNA，有利于全长有功能的SRSF3蛋白的表达。在外显子4的3’端有一个外显子剪切抑制子，能与PTPB1和PTBP2蛋白相互作用，促进了可变外显子4的跳过丢失，进而增加了全长有功能的SRSF3蛋白的表达，有利于癌症的发生和发展3。因此，建立抑制细胞中前体mRNA的SRSF3基因中外显子4在剪切中的跳跃丢失是亟待解决的问题。[0004]反义药物又称反义寡核苷酸药物，是指作为药物使用的，长度为10-30个碱基的人工合成DNA分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定基因的mRNA杂交，在转录水平上干扰致病蛋白质的产生过程。蛋白质在人体代谢过程中扮演重要角色，大多数疾病都是由于蛋白质异常引起的，无论肿瘤、心血管疾病或传染性疾病，传统药物主要直接作用于致病蛋白质本身，而反义药物则作用于产生蛋白质的mRNA，因此可广泛应用于各种疾病的治疗，比传统药物更具选择性，而且具有高效低毒、用量少等特点。数年前，由于反义药物合成价格昂贵，使该类药物难以进行广泛的临床试验。近年来，由于合成技术的改进和合成仪器的研制成功，反义药物的成本已大为降低，从而加速了反义药物的研究与开发。[0005]从药动学角度而言，由于体内各器官组织存在核酸酶，因此天然的寡核苷酸进入体内极易被分解失活，故反义药物多以修饰寡核苷酸为主，以增强其抗核酸酶降解的作用。[0006]反义基因治疗依据碱基互补原理，应用能与目的基因或其mRNA互补的核酸，通过空间阻遏作用，诱导RNA酶HRNaseH活性或与目的DNA双股螺旋形成三聚体triplehelix，在基因复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译水平上，抑制蛋白质合成的特性、抑制癌基因的表达、抑制生长因子的分泌或封闭其受体，从而阻断癌细胞内的异常信号传导及自分泌和旁分泌环路，使癌细胞进入正常化轨道或引起癌细胞凋亡。[0007]通过对反义寡核苷酸药物的开发和研宄，目前已有17种反义寡核苷酸药物进入临床试验。其中年经FDA批准进入市场的反义药物，其分子结构的两端有一个修饰帽，从而增强了其稳定性。该药物抗病毒作用较强，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病并发巨细胞视网膜炎。不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为25%，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。参考文献[0008]1.Zhang,J.andManley,J.L.,CANCERDISCOV,2013,3,1228-1237.[0009]2.Jia,R.,Li,C.,McCoy,J.P.,Deng,C.X.andZheng,Z.M.,INTJBIOLSCI,2010,6,806-826.[0010]3.Guo,J.JiaJ.andJia,R.,SciRep,2015,5,14548.发明内容[0011]本发明的目的就是提供一种可有效抑制肿瘤的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸特异性地在前体mRNA水平靶向原癌基因SRSF3,对表达全长有功能的SRSF3蛋白的肿瘤细胞的生物学行为进行干预，从而有效抑制全长有功能的SRSF3蛋白的表达，达到抗肿瘤效果。[0012]在本发明的第一方面中，提供了一种反义寡核苷酸，抑制SRSF3基因中可变外显子4上外显子剪切抑制子的功能，从而抑制SRSF3表达全长有功能的SRSF3蛋白，其分子式为：5’-GITTCAACAAGCTAGAAATG-3’，所有碱基都经2’-0-Methyl修饰和硫代修饰。[0013]本发明的第二方面，还涉及一种组合物，其含有0.001-99.99%如前所述的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。[0014]本发明的第三方面，提供了如前所述的反义寡核苷酸的用途，它被用于制备抑制肿瘤细胞生长组合物或治疗肿瘤的药物组合物。更佳地，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达全长有功能的SRSF3蛋白。更佳地，所述的肿瘤细胞为口腔癌细胞。[0015]目前癌症的治疗依然有很多难点，治疗效果还很不理想。SRSF3是癌基因，癌细胞的增殖和成瘤需要全长有功能的SRSF3蛋白。本发明针对癌基因SRSF3,利用2’-0-Methyl修饰和硫代修饰的反义寡核苷酸抑制SRSF3基因外显子4的外显子剪切抑制子的功能，促进了可变外显子4的剪切，进而减少了全长有功能的SRSF3蛋白的表达，抑制了口腔癌细胞的生长，具有抑制口腔癌的开发和应用前景。附图说明[0016]图1为反义寡核苷酸SR-3促进SRSF3外显子4的可变剪切[0017]A.SRSF3外显子4的可变剪切的示意图，方框表示外显子，外显子间的横线表示内含子，虚线表示RNA剪切的方向。STOP:终止密码子；DegradedbyNMD:由non-sense-mediateddegradationNMD机制介导的mRNA降解；[0018]B.外显子4的3’端有一个外显子剪切抑制子ESS，SR-3是反义寡核苷酸；[0019]C.将SR_3转入CAL27细胞中，用RT-PCR检测外显子4的可变剪切。[0020]图2为SR-3抑制SRSF3的表达和口腔癌细胞的生长•[0021]A.将20nM经2’-〇-Methyl和硫代修饰的反义寡核苷酸转染CAL27细胞，3天后进行细胞计数和结晶紫染色；[0022]B.用western杂交检测SRSF3蛋白的表达水平，Actin作为上样量的对照。具体实施方式[0023]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。[0024]【实施例1】SRSF3基因的外显子4的外显子剪切抑制子的反义寡核苷酸的获得[0025]根据我们己发表的研宄结果3,我们确定SRSF3外显子4的外显子剪切抑制子及其上下游的邻近序列CCTCACCTCACCATTTCTAGCTTGTTGAMCCCA划线的是外显子剪切抑制子序列）。根据这个序列我们设计了反义寡核苷酸SR-3,其序列为GTTTCMCAAGCTAGAMTG。我们设计了一个非特异性的反义寡核苷酸NS作为对照，其序列是:ACTCTATCTGCACGCTGACT。[0026]在生工生物工程上海股份有限公司合成了这些反义寡核苷酸，每个反义寡核苷酸的碱基都做了2’-0-Methyl和硫代修饰。[0027]【实施例2】反义寡核苷酸SR-3促进SRSF3外显子4的可变剪切并抑制SRSF3蛋白的表达和口腔癌细胞的生长。[0028]利用脂质体转染剂Lipofecatmin3000Thermofisher公司），将反义寡核苷酸转染CAL27细胞，终浓度为20nM。24小时后提取细胞总RNA，然后进行RT-PCR反应，具体包括：[0029]1逆转录[0030]取lygRNA样本进行DNA酶处理，加luLlOXDNasebufferThermofisher公司）和1yLDNaseIlUyLThermofisher公司），加无RNA酶水补足体积至10uL。混均后，室温静置10min。然后加入lyL25mMEDTA溶液，65°C10分钟，中止DNA酶的作用。取出9uL处理好的RNA样本，加lyLRandomPrimersPromega公司）和无RNA酶水4uL，70°C孵育5min后，立即取出置冰上。再加入1.25uLdNTPsThermofisher公司）、0.125uLRNaseinhibitorPromega公司）、5uL5XMMLVbufferPromega公司）、lliLMMLV逆转录酶（Promega公司）和无RNA酶水3•625uL。混勾后置37°C60min，完成逆转录，得到cDNA。[0031]2RT-PCR[0032]取luLcDNA，加12.5uL2XPremixTaqDNA聚合酶混合物Takara公司）、luL正向引物（10UM、lul反向引物（lOuM和9.5ul无RNA酶水。检测包含SRSF3第四个外显子的引物序列是:5’CTCCCTCTTGGGGTCGTCGC3’和5’CATGTGAAACGACACCAGCCAAGC3’。检测跳过SRSF3第四个外显子的引物序列是：5’CCATAGAGAATTACACCTTTGTGTCACTG3’和5’AGTCCTCCACCTCGTCGCAGATCTC3’。检测内对照GAPDH的引物序列是：5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3’和5’GMGATGGTGATGGGATTTC3’。反应参数是：94°C2min，经35个循环94°C20秒，57°C30秒，72°C1分钟）后72°C7分钟。反应完成后在2%的琼脂糖凝胶中电泳观察反应产物。结果表明反义寡核苷酸SR-3可以高效地抑制能够抑制外显子剪切抑制子功能，促进外显子4保留在mRNA中（图1。[0033]3利用脂质体转染剂Lipofecatmin3000Thermofisher公司），我们将反义寡核苷酸转染CAL27细胞，终浓度为20nM。3天后用〇•25%的胰酶-EDTAThermofisher公司）消化细胞，并计数。或者不消化细胞，用1%结晶紫溶液给细胞染色，以直观显示细胞的数量。结果发现，SR-3反义寡核苷酸可以显著地抑制CAL27细胞的生长图2A。[0034]在第3天收集上述转染细胞的总蛋白，对SRSF3蛋白表达水平进行分析。将蛋白质样本在10%的SDS-PAGE胶Thermofisher公司）中分离，用Western转印仪Biorad公司）在60V电压下经2个小时转移到硝酸纤维素膜Pall公司）上。将膜用5%脱脂牛奶封闭膜1个小时，与小鼠抗SRSF3抗体SantaCruz公司，1:1000稀释孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体Sigma公司，1:10000孵育1小时，用发光底物Thermofisher和X线胶片检测特异性SRSF3蛋白的表达水平。结果发现，SR-3可以显著地抑制SRSF3蛋白的表达（图2B。

权利要求：1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，其分子式为：5’-GTTTCAACAAGCTAGAAATG_3’，所有碱基都经2’-0-Methyl修饰和硫代修饰。2.—种组合物，其特征在于，其含有〇.〇〇1-99•"%如前所述的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。3.权利要求1所述的反义寡核苷酸的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤细胞生长组合物或治疗肿瘤的药物组合物。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达全长有功能的SRSF3蛋白。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞为口腔癌细胞。

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