申请/专利权人：伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心;新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心;伊犁职业技术学院

申请日：2017-07-11

公开（公告）日：2020-11-24

公开（公告）号：CN107177690B

主分类号：C12Q1/6851(20180101)

分类号：C12Q1/6851(20180101);C12Q1/689(20180101);C12Q1/06(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.06.24#未缴年费专利权终止;2017.11.10#实质审查的生效;2017.09.19#公开

摘要：本发明属于病原检测技术领域，公开了一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针5′端采用比较成熟的FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团。本发明的方法与其它病原无交叉反应；对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10拷贝μL的阳性质粒；重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2％。

主权项：1.一种在蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测中应用的探针及引物，其特征在于，所述探针为两条探针，一条探针5′端采用FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记，两条探针3′端选用BHQ1非荧光淬灭基团；一对幼虫芽孢杆菌引物P.larvaeFP.larvaeRSEQIDNO：1和一条探针P.larvaePSEQIDNO：2、一对蜂房蜜蜂球菌引物M.plutonFM.plutonRSEQIDNO：3和一条探针M.plutonPSEQIDNO：4；所述探针及引物在蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测中的应用流程为：DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；对照设置：幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；25μLPCR反应体系配置：在PCR管中加入PremixExTaq12.5μL，P.larvaeF1μL，P.larvaeR1μL，P.larvaeP1μL，M.plutonF1μL，M.plutonR1μL，M.plutonP1μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O5.5μL，使反应总体积为25.0μL；PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、59℃退火延伸50s，共40个循环，退火延伸时收集荧光信号；结果判定：阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，并且无扩增曲线，阳性对照同时使用幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌DNA或混合阳性质粒，应同时有FAM和VIC荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均≤35.0，对分别只单独使用幼虫芽孢杆菌DNA或蜂房蜜蜂球菌DNA或其阳性质粒，则各管对应只出现FAM或VIC荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且Ct值都分别≤35.0，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品有FAM和VIC荧光同时被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均≤35.0，判定为阳性，表明从样品中同时检出幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌，只有FAM荧光被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，判定为阳性，表明从样品中只检出幼虫芽孢杆菌，只有VIC荧光被检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，判定为阳性，表明从样品中只检出蜂房蜜蜂球菌，无FAM或VIC荧光被检出，且无扩增曲线，无Ct值，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值35.0的样品重新检测，重新检测结果无FAM或VIC荧光被检出，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌，重新检测结果有FAM或VIC荧光被检出，判定为阳性，表明从样品中检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌。

全文数据：蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan焚光定量PGR检测方法技术领域[0001]本发明属于病原检测技术领域，尤其涉及一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。背景技术[0002]蜜蜂美洲幼虫腐臭病AmericanFoulbroocUAFB和欧洲幼虫腐臭病EuropeanFoulbrood，EFB，是蜜蜂幼虫两种重要的细菌性疾病，病原体分别为幼虫芽孢杆菌Paenibacilluslarvae，P.larvae和蜂房蜜蜂球菌（Melissococcuspluton，M.pluton，呈世界性分布，世界动物卫生组织OIE将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病，是我国转地养蜂和世界各国在进境蜂及蜂产品中重点检疫的两种蜜蜂疫病。P.larvae在一定条件下能产生芽孢，具有特别强的生存能力，病原很难控制和净化;M.pluton虽不产生芽孢，但对外界不良环境的抵抗力强，能在蜂尸上存活数年，在蜂蜜里也能保持长久的毒性，传染性极强。AFB和EFB均感染和危害蜜蜂幼虫，且病症相似，易发生误诊，因此开展对AFB和EFB的同步鉴别及早期诊断研究具有重要意义。目前，AFB和EFB的实验室诊断方法主要包括细菌涂片镜检、分离培养、凝集试验和核酸检测等方法，已有诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，由于幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，分离培养困难，上述诊断方法很难对美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病做出准确诊断和推广应用，已报道的AFB和EFB多重PCR诊断方法为普通PCR，该方法只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量和对扩增反应实时监测，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，流程较复杂，且在实验室内使用EB等有毒物质，已报道的荧光定量PCR均为单重PCR方法，无法实现在同一反应管中同时检测两种病原的目的，国内外未见有AFB和EFB病原菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的报道。[0003]综上所述，现有技术存在的问题是：[0004]1.分离培养、凝集试验等方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，分离培养困难，对该病很难做出准确诊断，诊断方法也很难推广应用。[0005]2.国外在AFB和EFB的实验室诊断方面建立了多种PCR方法，但我国缺少具有自主知识产权的快速、准确、高通量、易于推广的PCR方法，不利于我国蜜蜂疫病的防控。[0006]3.目前，已建立的AFB和EFB多重PCR诊断方法为普通PCR，只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量和对扩增反应实时监测，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，流程较复杂，且在实验室内使用EB等有毒物质。[0007]4.目前，已建立的AFB和EFB荧光定量PCR均为单重PCR方法，无法实现在同一反应管中同时检测两种病原的目的。发明内容[0008]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。[0009]本发明是这样实现的，一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针57端采用比较成熟的FAM作为荧光报告基团，另一条探针5'端选择VIC作为标记，两条探针3'端选用BHQl非荧光淬灭基团。[0010]进一步，具体检测流程为：[0011]I、DNA抽提:采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA;[0012]2、对照设置:幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；[0013]3、25yLPCR反应体系配置：在PCR管中加入PremixExTaq2X12.5yL，P.larvaeF10ymolLlyL,P.larvaeR10ymolLlyL,P.larvaeP10ymolLlyL,M.plutonF10μmolLlyL，M.plutonR10ymolLlyL，M.plutonP10ymolLlyL，模板DNAlyL，加灭菌ddH205.5yL，使反应总体积为25.OyL;[00M]4、PCR反应程序:94°C预变性2min;94°C变性15s、59°C退火延伸50s，共40个循环，退火延伸时收集荧光信号；[0015]5、结果判定：阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，并且无扩增曲线，阳性对照同时使用幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌DNA或混合阳性质粒，应同时有FAM和VIC荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均35.0的样品重新检测，重新检测结果无FAM或VIC荧光被检出，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌，重新检测结果有FAM或VIC荧光被检出，判定为阳性，表明从样品中检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌。重新检测需从提取DNA开始重新检测，可从多个方面尽量提高检出率，根据各种具体情况在可选使用量的几个因素中调整优化检测过程，如增加样品取样量、减少溶解DNA的TE剂量、增加PCR反应中加入的模板量、适当增加PCR反应循环数等。也可以针对其中一种可疑存在的病原菌进行单一荧光定量PCR检测。[0016]本发明的优点及积极效果为:为快速鉴别诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病AFB和欧洲幼虫腐臭病（EFB，根据GenBank中登陆的幼虫芽孢杆菌（P.larvae和蜂房蜜蜂球菌M.pluton16SrRNA基因序列分别设计特异性引物和探针，建立了双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明：本发明的方法与其它病原无交叉反应;对P.larvae和M.pluton的检测灵敏度均达10拷贝AL的阳性质粒;重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于2%。对200份实验室模拟样品和200份临床样品进行了检测，与预期结果一致。[0017]本发明建立的方法可用于AFB与EFB的快速鉴别诊断、早期监测、蜂产品中P.larvae和M.pluton的定量分析;建立AFB和EFB病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，为AFB和EFB的早期同步诊断、蜂及蜂产品中P.larvae和M.pluton的检验检疫提供技术保障。[0018]本发明建立的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可直接用于临床样品及受污染的蜂产品中幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌的检测，无需病原培养，操作简单，结果准确，适用于早期监测，易于推广应用。[0019]本发明建立的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的引物和探针是自行设计，通过试验参数优化获得最佳反应体系和反应条件，填补了国内外使用该方法对蜜蜂美洲幼虫腐臭病和欧洲幼虫腐臭病开展同时鉴别诊断的空白，属我国自主研发的蜂病诊断方法，为我国蜂病防控提供新的有效的技术手段。[0020]本发明建立的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法试验过程全封闭，仪器自动分析和获取试验结果，无后续试验操作，可对起始模版准确定量和扩增反应实时监测，方法特异性、灵敏度、自控化程度等均高于普通PCR。[0021]本发明建立的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可在同一反应管同步检测幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌两种病原，也可以针对其中一种可疑存在的病原菌进行单一荧光定量PCR检测，具有快速、灵敏、高通量等特点，节省检测时间和检测费用。附图说明[0022]图1是本发明实施例提供的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法流程图。[0023]图2是本发明实施例提供的P.larvae阳性模板的扩增示意图；[0024]图中：M:DL2000DNAMarker;I:PCRproduct;2:Negativecontrol〇[0025]图3是本发明实施例提供的M.pluton阳性模板的扩增示意图；[0026]图中：M:DL2000DNAMarker;I:PCRproduct;2:Negativecontrol〇[0027]图4是本发明实施例提供的双重焚光定量PCR检测pXT-P标准品的标准曲线示意图。[0028]图5是本发明实施例提供的双重荧光定量PCR检测pXT-M标准品的标准曲线示意图。[0029]图6是本发明实施例提供的双重荧光定量PCR特异性试验扩增曲线示意图；[0030]图中：1:M·pluton;2:P·larvae;3:Nosemaapis;4:Asosphaeraapis;5:Sacbroodbeevirus；6：Chronicbeeparalysisvirus;7:健康蜜蜂幼虫。[0031]图7是本发明实施例提供的双重荧光定量PCR敏感性试验示意图；[0032]图中：1-8:P·larvae1·3X107copiesyL〜1·3X10°copiesyL;A_H:M.plutonI.OX107copiesyL~l.OX10°copiesyL；N：Negativecontrol。[0033]图8是本发明实施例提供的普通PCR敏感性试验示意图。具体实施方式[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0035]下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。[0036]本发明实施例提供的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用一条探针5'端采用比较成熟的FAM作为荧光报告基团，另一条探针5'端选择VIC作为标记，两条探针3'端选用BHQl非荧光淬灭基团。一对幼虫芽孢杆菌引物P.larvaeFP.larvaeRSEQIDN0:l和一条探针P·larvaePSEQIDN0:2、一对蜂房蜜蜂球菌引物M·plutonFM.plutonRSEQIDN0:3和一条探针M.plutonPSEQIDN0:4。[0037]如图I所示，本发明实施例提供的蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：[0038]SlOl:DNA抽提:采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA;[0039]S102:对照设置:幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；[0040]S103:25yLPCR反应体系配置：在PCR管中加入PremixExTaq2X12.5yL，P.larvaeF10ymolLlyL,P.larvaeRIOymoILIyL,P.larvaeP10ymolLIyL,M.plutonF10ymolLlyL，M.plutonR10ymolLlyL，M.plutonP10ymolLlyL，模板0嫩]^1^，加灭菌1册2〇5.5以1^使反应总体积为25.^1^[0041]3104:?〇?反应程序：94°：预变性21^11;94°：变性158、59°：退火延伸508，共40个循环，退火延伸时收集焚光信号；[0042]S105:结果判定：阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，并且无扩增曲线，阳性对照同时使用幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌DNA或混合阳性质粒，应同时有FAM和VIC荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均35.0,对分别只单独使用幼虫芽孢杆菌DNA或蜂房蜜蜂球菌DNA或其阳性质粒，则各管对应只出现FAM或VIC荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且Ct值都分别35.0,说明试验为有效试验，否则试验无效。[0043]下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。[0044]1材料与方法[0045]1.1菌毒虫株P.larvae购自北京北纳创联生物技术研究院，M.pluton购自美国典型培养物保藏中心，蜜蜂微孢子虫Nosemaapis、蜜蜂球囊菌Asosphaeraapis、囊状幼虫病毒（Sacbroodbeevirus、慢性蜜蜂麻瘦病病毒Chronicbeeparalysisvirus由伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心分离保存。[0046]1.2主要试剂和仪器基因组DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；PremixExTaqProbeqPCR、PrimeScriptRT-PCRKit、pXT19_Tvector、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等购自宝生物工程大连有限公司。ABI7500RealTimePCRSystem购自美国应用生物系统公司。[0047]1·3引物和探针的设计与合成根据GenBank登录的P.larvae和M.plutonl6SrRNA基因保守序列，使用PrimerPrimier5和PrimerExpress3.0软件分别设ir|对幼虫芽孢杆菌引物P.larvaeFP.larvaeRSEQIDNO:1和一条探针P.larvaePSEQIDNO:2、一对蜂房蜜蜂球菌引物M.plutonFM.plutonRSEQIDN0:3和一条探针M.plutonPSEQIDN0:4表1。引物和探针由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。[0048]表1引物和探针序列[0050]1.4标准品的制备提取P.larvae和M.pluton基因组作为模板，应用特异性引物分别进行普通PCR扩增，分别将PCR产物克隆至pXT19-TVector，构建重组质粒pXT-P和pXT-M，转化至E.coliDH5a感受态细胞，37°C过夜摇菌后提取质粒进行普通PCR和测序验证，鉴定正确的重组质粒测定浓度，作为双重荧光定量PCR的标准品。[0051]1.5反应体系和条件优化单重、双重荧光定量PCR均采用PremixExTaqProbeqPCR试剂，在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行试验。双重荧光定量PCR反应体系中引物、探针浓度和反应条件中退火、延伸温度和时间在单重荧光定量PCR反应体系和反应条件的基础上优化。[0052]1.6标准曲线的建立将pXT-P和pXT-M标准品做10倍系列稀释，用不同稀释梯度的标准品作为模板，按优化好的体系条件进行双重荧光定量PCR，绘制标准曲线。[0053]1.7特异性试验分别提取P.larvae、M.pluton、Nosemaapis、Asosphaeraapis、Sacbroodbeevirus、Chronicbeeparalysisvirus、健康蜜蜂幼虫核酸，Sacbroodbeevirus和ChronicbeeparalysisvirusRNA反转录成cDNA后，进行单一及双重焚光定量PCR检测，确定该方法的特异性。[0054]1.8敏感性试验用已知浓度的pXT-P和pXT-M标准品进行10倍系列稀释8个梯度1〇7拷贝AiL〜IOt3拷贝AiL，分别作为模板，按优化好的体系条件进行双重荧光定量PCRJ定反应的最小检出量。同时进行普通PCR反应，比较两种检测方法的敏感性。[0055]1.9重复性试验选取5个10倍系列稀释的pXT-P和pXT-M标准品分别作为模板，各浓度进行3次重复检测，根据Ct值计算批内变异系数；以上述不同浓度的标准品分别作为模板，在3个不同时间进行荧光定量PCR检测，根据Ct值计算批间变异系数，评价该方法的重复性和稳定性。[0056]1.10实验室模拟样品和临床样品检测将定量的不同稀释度的pXT-P和pXT-M标准品掺入幼虫、蜂蛹、成蜂、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉样品中制成200份实验室模拟样品；采自新疆的200份蜜蜂幼虫及蜂产品作为临床样品，应用建立的双重荧光定量PCR方法进行检测。[0057]2结果[0058]2.1标准品的制备将P.larvaeDNA和M.plutonDNA进行普通PCR扩增，获得长度约为130bp和160bp的目的片段（图2，图3，PCR产物经测序分析，与GenBank中登录序列的同源性达到100%。将目的片段克隆于PXT19-TVector中构建pXT-P和pXT-M重组质粒标准品，经普通PCR和测序鉴定正确。[0059]2.2反应体系和反应条件优化通过采用矩阵法优选引物、探针最佳浓度配比及退火、延伸温度和时间。优化后的双重荧光定量PCR反应体系和反应条件表2。[0060]表2双重荧光定量PCR反应体系和反应条件[0061][0062]2.3标准曲线的建立将?乂1'-?和?乂1'-1标准品10倍系列稀释，进行双重荧光定量PCR，获得了标准曲线，结果表明标准品浓度在IO7拷贝AiL〜10拷贝AxL具有良好的线性关性，两条标准曲线的相关系数均为R2=O.999。线性方程分别为Ct=-3.381XlogC0+36.56pXT-P图4和Ct=-3.495XlogC0+41.24pXT-M图5。[0063]2·4特异性试验双重荧光定量PCR特异性检测结果显示，P·larvae及M·pluton均产生扩增曲线，且循环阈值均小于35。而其它病原、健康蜜蜂幼虫均未产生扩增曲线（图6。[0064]2.5敏感性试验将10倍系列稀释的8个梯度（IO7拷贝AiL〜10°拷贝AiL的pXT-P和ρΧΤ-Μ标准品，分别作为模板进行双重荧光定量PCR和普通PCR检测，结果显示双重荧光定量PCR最小检出量为10拷贝AiL图7，普通PCR最小检出量为IO3拷贝AiL图8，表明荧光定量PCR的敏感性比普通PCR提高了约100倍。[0065]2.6重复性试验选取5个10倍倍比稀释的pXT-P和ρΧΤ-Μ标准品进行批内和批间重复性试验，根据扩增反应的Ct值，计算变异系数CV，结果显示变异系数均小于2%表3，表明所建立的方法具有较好的重复性。[0066]表3双重荧光定量PCR重复性试验[0067][0068]2.7样品检测应用建立的双重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对200份实验室模拟样品和采自新疆的200份蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品进行检测，结果加入pXT-P和pXT-M标准品浓度10拷贝yL以上的实验室模拟样品双重荧光定量PCR检测均为阳性，加入pXT-P和pXT-M标准品浓度IO3拷贝AxL以上的实验室模拟样品普通PCR检测均为阳性，蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品两种检测方法结果均为阴性，表明该双重荧光定量PCR具有良好的临床灵敏性和应用性。[0069]AFB和EFB病原可以广泛分布在病蜂接触过的花粉、糖液、饲槽、巢脾等，这些都可以作为主要传染源，Ρ.larvae及Μ.pluton对外界都有着较强的抵抗力，同时盗蜂和迷巢蜂等使该病在蜂群中传播，所以要彻底清除这些病原是相当困难的，这也很大程度上影响着蜜蜂群势及蜂产品的产量与质量。两种疫病临床症状相似，易误诊，因此开展对AFB和EFB的同步鉴别及早期诊断研究具有重要意义。[0070]多重荧光定量PCR方法是在单重荧光定量PCR基础上发展的技术，在同一个反应体系中加入多套引物和探针，探针的5'端标记不同波长的发光基团，可同时对多种目标基因进行检测，具有快速、灵敏、高通量等特点，已成为实验室检测病原体及病理分析的主要手段之一。本发明建立了P.larvae及M.pluton的双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，实现了在同一反应管中同时检测两种病原的目的，节省了检测时间和检测费用。通过反应体系和条件优化解决了两对引物和探针之间相互干扰问题，设计探针时，P.larvae和M.pluton探针5'端分别标记荧光发射波长处于不同光谱范围的FAM和VIC报告基团，不易互相干扰，3'端标记BHQl作为荧光淬灭基团，该修饰基团本身不产生荧光，且淬灭效率更高，大大降低了本底信号的强度，提高了方法灵敏度。采用本发明建立的双重荧光定量PCR和普通PCR检测实验室制备的200份模拟样品和200份临床样品，结果表明本发明建立的双重荧光定量PCR方法灵敏度更高，技术验证试验表明该方法具有良好的特异性、重复性和广泛的适用性。本发明建立的TaqMan探针双重荧光定量PCR方法可用于AFB和EFB的快速鉴别诊断、早期监测、流行病学调查及蜂产品中P.larvae和M.pluton的定量分析。[0071]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法利用两条探针，一条探针5端采用FAM作为荧光报告基团，另一条探针5端选择VIC作为标记，两条探针3端选用BHQl非荧光淬灭基团；一对幼虫芽抱杆菌引物P·larvaeFP·larvaeRSEQIDNO:1和一条探针P.larvaePSEQIDN0:2、一对蜂房蜜蜂球菌引物M.plutonFM.plutonRSEQIDN0:3和一条探针M.plutonPSEQIDN0:4。2.如权利要求1蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法具体检测流程为：DNA抽提:采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA;对照设置：幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；25yLPCR反应体系配置：在PCR管中加入PremixExTaq12.5yL，P.larvaeFlyL，P.larvaeRlyL，P.larvaePlyL，M.plutonFlyL，M.plutonRlyL，M.plutonPlyL，模板0嫩]^1^，加灭菌1册2〇5.5以1^使反应总体积为25.^1^PCR反应程序:94°C预变性2min;94°C变性15s、59°C退火延伸50s，共40个循环，退火延伸时收集荧光信号；结果判定：阴性对照和空白对照无FAM和VIC荧光信号检出，无Ct值，并且无扩增曲线，阳性对照同时使用幼虫芽孢杆菌和蜂房蜜蜂球菌DNA或混合阳性质粒，应同时有FAM和VIC荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值均35.0的样品重新检测，重新检测结果无FAM或VIC荧光被检出，判定为阴性，表明从样品中未检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌，重新检测结果有FAM或VIC荧光被检出，判定为阳性，表明从样品中检出幼虫芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌。3.如权利要求2蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，重新检测需从提取DNA开始重新检测，根据各种具体情况在可选使用量的几个因素中调整优化检测过程，如增加样品取样量、减少溶解DNA的TE剂量、增加PCR反应中加入的模板量、适当增加PCR反应循环数;也针对其中一种可疑存在的病原菌进行单一荧光定量PCR检测。

百度查询： 伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心;新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心;伊犁职业技术学院 蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法

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