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申请/专利权人：南京林业大学

摘要：本发明公开了一种用于检测肼的2，3‑蒎二酮基咪唑型荧光探针及其制备方法和应用。本发明以天然可再生资源β‑蒎烯的衍生物2，3‑蒎二酮为原料，与对苯二甲醛和乙酸铵进行一步环化反应，得到4‑5，5‑二甲基‑4，5，6，7‑四氢‑1H‑4，6‑桥亚甲基苯并[d]咪唑‑2‑基苯甲醛；4‑5，5‑二甲基‑4，5，6，7‑四氢‑1H‑4，6‑桥亚甲基苯并[d]咪唑‑2‑基苯甲醛与2‑氰基乙酸乙酯进行缩合反应，得到2‑氰基‑3‑4‑5，5‑二甲基‑4，5，6，7‑四氢‑1H‑4，6‑桥亚甲基苯并[d]咪唑‑2‑基苯基丙烯酸乙酯。2‑氰基‑3‑4‑5，5‑二甲基‑4，5，6，7‑四氢‑1H‑4，6‑桥亚甲基苯并[d]咪唑‑2‑基苯基丙烯酸乙酯能与肼进行专一性反应，在365nm紫外光下溶液的荧光颜色由橙黄色变为蓝绿色，对肼具有专一性和高灵敏度的特点，作为检测肼用荧光探针具有很好的应用前景。

主权项：1.一种用于检测肼的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针，其特征在于，该荧光探针为2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯，结构式为：

全文数据：一种用于检测肼的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针及其制备方法和应用技术领域本发明属精细有机合成技术领域，涉及一种用于检测肼的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针及其制备方法。背景技术肼作为一种重要的生化试剂、精细化学品、反应碱和还原剂，广泛应用于除氧剂、医药、缓蚀剂、农药、纺织染料、火箭燃料、重氮燃料等行业。然而，尽管肼广泛应用，但它对人和动物具有高度毒性和腐蚀性。吸入其蒸汽可能导致头晕、恶心和中枢神经系统兴奋。它的蒸汽刺激眼睛，对眼睛造成永久性的伤害。长期暴露于高浓度肼可引起各种脏器损伤，中枢神经系统损伤。因此，寻找一种选择性好、灵敏度高的肼检测方法是十分必要和迫切的。截止到目前为止，许多方法应用到肼的探测方面，例如：毛细管电泳法、电化学分析法、化学发光法、色谱法等多种肼检测方法。然而，这些方法总是昂贵、耗时和复杂的。其中很少能用于细胞内肼的检测。在这些分析方法中荧光分析方法作为一种简单的、快速的、高选择性、高灵敏性的方法被广泛使用于生物体内的离子检测。由于其优异的敏感性、非侵入性和对生物样品良好的相容性，引起了人们的广泛关注。到目前为止，已报道了许多用于肼检测的荧光探针。近年来有许多关于有机荧光探针的合成和应用于肼检测的报道，例如：在2013年，以乙酰丙酸为离去基的半水杨酸类近红外肼探针用于血样和活细胞中肼的检测，这些探针显示出良好的灵敏度和选择性，但也存在合成路线长、效率低、检测不理想等缺点。在2017年，以4-硝基苯基作为联氨的荧光反应基团，在亲核芳香取代反应的基础上，开发了一种荧光开关型探针用于肼的检测及其活细胞成像。同时，近年来也出现许多咪唑类化合物作为荧光探针的报道，例如：Mn2+探针、Zn2+探针、F-探针、Zn2+探针、Fe3+探针。但没有关于诺蒎烷基咪唑类化合物应用于肼检测的报道。发明内容针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针，能与肼进行专一性反应，在365nm紫外光下溶液的荧光颜色由橙黄色变为蓝绿色。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针的制备方法。本发明还要解决的技术问题是提供一种2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于检测肼的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针，该荧光探针为2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯，结构式为：所述的2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的制备方法，包括如下步骤：1以天然可再生资源β-蒎烯的衍生物2，3-蒎二酮为原料，与对苯二甲醛和乙酸铵进行一步环化反应，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛；24-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛与2-氰基乙酸乙酯进行缩合反应，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯。步骤1中，2，3-蒎二酮与对苯二甲醛和乙酸铵进行一步环化反应，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛。具体制备过程为：1将0.02mol2，3-蒎二酮，0.02～0.04mol对苯二甲醛，0.02～0.1mol乙酸铵，40～60mL异丙醇依次加入100mL三口烧瓶中，回流反应2h，用薄层色谱法跟踪反应进程；2反应液经蒸馏除去异丙醇后，剩余物加入40～60mL二氯甲烷进行溶解，用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和食盐水洗涤1次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩回收二氯甲烷后，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛粗产物；34-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛粗产物经柱层析200～300目硅胶，洗脱液石油醚L酸乙酯比为3∶1，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛纯品。步骤2中，4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛与2-氰基乙酸乙酯进行缩合反应，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯。具体制备过程为：1将0.02mol4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛，0.02～0.04mol氰乙酸乙酯，1～10滴哌啶，20～60mL无水乙醇依次加入100mL三口烧瓶中，回流反应30min，并用薄层色谱法跟踪反应进程；2反应液经蒸馏除去乙醇后，剩余物加入40～60mL二氯甲烷进行溶解，用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和食盐水洗涤1次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩回收二氯甲烷后，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯粗产物；32-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯粗产物经柱层析200～300目硅胶，洗脱液石油醚乙酸乙酯比为3∶1，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯纯品。所述的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针在检测肼中的应用。2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯能与肼进行专一性反应，在365nm紫外光下溶液的荧光颜色由橙黄色变为蓝绿色。有益效果：与现有技术相比，本发明的利用天然可再生资源β-蒎烯的衍生物2，3-蒎二酮为原料制备新型的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针，能与肼进行专一性反应，在365nm紫外光下溶液的荧光颜色由橙红色变为蓝绿色，具有良好的专一性和灵敏度高的特点，作为检测肼用荧光探针具有很好的应用前景。附图说明图1是Ca2+、Al3+、Zn2+、Cr3+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Bi3+、La3+、NO2-、CH3COO-、HPO42-、CO32-、脲、甘氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、三乙胺、苯胺、二乙胺、环己胺、乙二胺、肼等25种不同分析物对2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的荧光光谱图的影响结果图；图2是不同浓度的肼对2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的荧光光谱图的影响结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例1诺蒎烷基咪唑类化合物的制备反应式为：具体步骤如下：14-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛的制备：将0.02mol2，3-蒎二酮，0.02mol对苯二甲醛，0.2mol乙酸铵，40～60mL异丙醇依次加入100mL三口烧瓶中，升温控制反应温度85℃，回流2h，并用薄层色谱法跟踪反应进程。反应液经蒸馏除去异丙醇后，剩余物加入40mL二氯甲烷进行溶解，用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和食盐水洗涤1次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩回收二氯甲烷后，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛粗产物，产物经柱层析200～300目硅胶，洗脱液石油醚乙酸乙酯比为3∶1，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛3.25g，得率60.9％，纯度97.4％。1HNMR600MHz，DMSO-d6δ：12.58d，J＝12Hz，1H，9.96s，1H，8.04d，J＝4Hz，1H，8.03d，J＝4Hz，1H，7.91d，J＝8Hz，2H，4.23t，J＝4Hz，2H，1.66-1.62m，2H，1.41d，J＝4Hz，3H，0.92t，J＝8Hz，2H，0.63d，J＝6Hz，3H.13CNMR150MHz，DMSO-d6δ：192.60，167.43，132.18，131.99，130.66，129.13，124.34，65.49，41.47，30.48，28.37，25.89，21.69，19.12，14.02.HRMSmz：[M+H]+calculatedforC17H18N2O+H+，267.1492；found，267.1498。22-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的制备：将0.02mol4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛，0.02～0.04mol氰乙酸乙酯，5滴哌啶，20mL无水乙醇依次加入100mL三口烧瓶中，回流反应30min，并用薄层色谱法跟踪反应进程。反应液经蒸馏除去乙醇，剩余物加入45mL二氯甲烷进行溶解，用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和食盐水洗涤1次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩回收二氯甲烷后，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯粗产物，粗产物经柱层析200～300目硅胶，洗脱液石油醚乙酸乙酯比为3∶1，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯5.52g，得率76.4％，纯度93.4％。1HNMR600MHz，DMSO-d6δ：12.62s，1H，8.31s，1H，8.08d，J＝4Hz，2H，7.99d，J＝4Hz，2H，4.33-4.30m，2H，4.21t，J＝4Hz，1H，2.76-2.73m，2H，2.33-2.30m，1H，1.65-1.61m，1H，1.39s，2H，1.30t，J＝4Hz，3H，0.90t，J＝4Hz，2H，0.61s，3H.13CNMR150MHz，DMSO-d6δ：162.64，154.61，141.34，136.08，132.26，131.94，129.53，129.12，124.36，116.56，100.58，65.46，62.67，42.56，41.59，33.93，30.48，26.82，21.69，19.12，14.48，14.00.HRMSmz：[M+H]+calculatedforC22H23N3O2+H+，362.1863；found，362.1866。实施例2将2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯和Ca2+、Al3+、Zn2+、Cr3+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Bi3+、La3+、NO2-、CH3COO-、HPO42-、CO32-、脲、甘氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、三乙胺、苯胺、二乙胺、环己胺、乙二胺、肼等25种不同的金属离子、阴离子、氨基酸以及胺类溶于PBSC2H5OHvv＝82缓冲液中，配制成浓度为1.0×10-6M的探针溶液和浓度为1.0×10-5M的25种不同分析物溶液，测定不同的分析物对2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的荧光发射光谱的影响，如图1所示。结果表明，加入肼使得体系的荧光强度明显增强，在365nm紫外光下溶液的荧光颜色由橙红色变为蓝绿色，而通过加入其他干扰物Ca2+、Al3+、Zn2+、Cr3+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Bi3+、La3+、NO2-、CH3COO-、HPO42-、CO32-、脲、甘氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸、三乙胺、苯胺、二乙胺、环己胺、乙二胺等对比观察，溶液的荧光并没有变化。说明该化合物可以作为专一性识别肼的荧光探针。实施例3将2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯配制成浓度为5×10-6M的PBSC2H5OHvv＝82缓冲溶液，同样将肼溶于PBSC2H5OHvv＝82缓冲溶液配成浓度为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、140、150μM的溶液，测定不同浓度的肼对2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的荧光发射光谱的影响，结果如图2所示。结果表明，随着体系中肼浓度的不断增加，溶液的荧光强度随之增强，由此说明，该化合物可以作为比率型荧光探针对肼进行检测。

权利要求：1.一种用于检测肼的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针，其特征在于，该荧光探针为2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯，结构式为：2.权利要求1所述的2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1以天然可再生资源β-蒎烯的衍生物2，3-蒎二酮为原料，与对苯二甲醛和乙酸铵进行一步环化，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛；4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛与2-氰基乙酸乙酯进行缩合反应，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯；24-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛与2-氰基乙酸乙酯进行缩合反应，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯。3.根据权利要求2所述的2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的制备方法，其特征在于，步骤1中，2，3-蒎二酮与对苯二甲醛和乙酸铵进行一步环化反应，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛。具体制备过程为：1将0.02mol2，3-蒎二酮，0.02～0.04mol对苯二甲醛，0.02～0.1mol乙酸铵，40～60mL异丙醇依次加入100mL三口烧瓶中，回流反应2h，用薄层色谱法跟踪反应进程；2反应液经蒸馏除去异丙醇后，剩余物加入40～60mL二氯甲烷进行溶解，用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和食盐水洗涤1次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩回收二氯甲烷后，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛粗产物；34-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛粗产物经柱层析200～300目硅胶，洗脱液石油醚乙酸乙酯比为3∶1，得到4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛纯品。4.根据权利要求2所述的2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯的制备方法，其特征在于，步骤2中，4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛与2-氰基乙酸乙酯进行缩合反应，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯。具体制备过程为：1将0.02mol4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯甲醛，0.02～0.04mol氰乙酸乙酯，1～10滴哌啶，20～60mL无水乙醇依次加入100mL三口烧瓶中，回流反应30min，并用薄层色谱法跟踪反应进程；2反应液经蒸馏除去乙醇，剩余物加入40～60mL二氯甲烷进行溶解，用蒸馏水洗涤至中性，再用饱和食盐水洗涤1次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩回收二氯甲烷后，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯粗产物；32-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯粗产物经柱层析200～300目硅胶，洗脱液石油醚乙酸乙酯比为3∶1，得到2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯纯品。5.权利要求1所述的2，3-蒎二酮基咪唑型荧光探针在检测肼中的应用。2-氰基-3-4-5，5-二甲基-4，5，6，7-四氢-1H-4，6-桥亚甲基苯并[d]咪唑-2-基苯基丙烯酸乙酯能与肼进行专一性反应，在365nm紫外光下溶液的荧光颜色由橙黄色变为蓝绿色。

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