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申请/专利权人：广东医科大学

摘要：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可同时识别NDM‑1NewDelhimetallo‑beta‑lactamase1和VIM‑2Veronaintegron‑encodedmetallo‑beta‑lactamase2的核酸适体APNV，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。NDM‑1和VIM‑2是常见的两种金属‑β‑内酰胺酶，底物谱较广泛，可以水解除氨曲南外的几乎所有β‑内酰胺类抗生素，且不能被临床上的β‑内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸等抑制。本发明采用SELEX技术筛选获得了一种可高亲和力同时结合NDM‑1和VIM‑2的核酸适体APNV，结合的亲和力相比单克隆抗体更高，能够同时检测NDM‑1和或VIM‑2耐药细菌，检测时间短，特异性强，稳定性好，成本低廉，易于保存和运输，无需复杂的实验条件，检测方法简单易行，能够应用于临床快速诊断，具有广泛的应用前景。

主权项：1.一种可同时识别NDM-1和VIM-2的核酸适体APNV，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

全文数据：一种可同时识别NDM-1和VIM-2的核酸适体技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用分子生物学技术筛选到一种可同时识别NDM-INewDelhimetalI〇-beta-lactamaseI和VIM-2Veronaintegron-encodedmetallo-beta-lactamase2的核酸适体及其筛选方法和应用。背景技术[0002]1983年报道了第一例携带质粒编码的能水解三代头孢菌素的超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯杆菌，之后耐药菌的发现报道便屡见不鲜。碳青霉稀类抗生素由于对超广谱内酰胺酶的水解作用稳定，一直被用于治疗产超广谱内酰胺酶的耐药菌感染。临床常用的碳青霉烯类抗生素主要有美罗培南，亚胺培南等，随着应用越来越广，国内外己出现大量对此类药物耐药的肠杆菌科细菌，及多重耐药菌株，这类细菌被称为“超级细菌”。近年来，“超级细菌”掀起了继甲型HlNl流感之后全球的又一新“浪潮”，引起人们的恐慌。“超级细菌”能产生一种特殊的β-内酰胺酶，由于活性中心为金属离子，属于β-内酰胺酶的B型酶，又称为金属β-内酰胺酶Metall〇-beta_lactamases，MBLs，携带有新德里金属β-内酰胺酶NewDelhimetallo-beta-lactamase1，NDM_1耐药基因的超级肺炎克雷伯杆菌便是“超级细菌”中的一种，于2009年首次在印度新德里被发现，其不仅可以水解除氨曲南外几乎所有内酰胺类抗生素，NDM-I编码基因还常与其他耐药基因共存共转移扩大底物谱。[0003]除了NDM-1夕卜，目前已发现的金属β-内酰胺酶还有VIM-2Veronaintegron-encodedmetallo-beta-lactamase2，于2000年法国科学家首次报道了从1株绿胺假单胞菌中检出了金属酶基因blaVIM-2,后因2009年报道的NDM-I与V頂-2序列相似度极高而再次被广泛关注，VIM-2的氨基酸序列与NDM-I有约32%的氨基酸序列相似，两者基因可通过质粒或整合子机制在不同种细菌间进行水平传播，给临床治疗带来严重的威胁，至今还未发现临床有效的抑制剂。因此，加强对携带NDM-I和VIM-2基因的细菌进行检测对于临床治疗而言极为重要。[0004]目前，对于金属β内酰胺酶的检测，主要有表型检测和基因检测两种，根据国家公布的《产NDM—1泛耐药肠杆科细菌感染诊疗指南》试行版规定，携带blaNDM-Ι耐药菌的实验室检测包括表型筛查、表型确认和基因确证三个步骤，先进行表型检测，然后对产金属酶的细菌进行基因确证。表型检测只能鉴定细菌是否产生金属酶，如CN103597092公开了检测生物学样品中抗碳青霉烯类的细菌的方法，使样品与包含显色底物以及法罗培南和或多利培南的培养基接触，整体温育以允许细菌生长，检测对应于抗碳青霉烯类的细菌的菌株。对金属酶类型的诊断还需依赖基因检测技术，例如CN105400875公开了一种细菌耐药基因NDM-I的实时荧光定量PCR检测方法，该检测方法特异性强，灵敏度高，配合质粒标准分子能够检测细菌耐药基因NDM-I;CN106754906公开了用于检测耐碳青霉烯类抗生素的七种耐药基因的LAMP引物组合及其应用，包括了耐药基因VIM-2的检测，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。还有基于核酸适体的临床快速诊断技术，如CN102965377公开了一种新德里金属β内酰胺酶1核酸适体及其筛选方法和应用，该核酸适体能够高亲和力和高特异性结合NDM-I，能够替代传统抗体用于金属β内酰胺酶的快速诊断方法。上述检测方法虽然能够对耐药细菌进行检测，但是在临床实际应用中仍面临诸多问题，基于细菌培养的表型检测耗时较长，难以直接确证，容易导致病情的延误，而基于耐药基因的检测通常是针对单一耐药基因的检测，目前现有技术中还缺乏针对细菌多种耐药基因同时检测的方法或试剂盒，尤其针对细菌金属β内酰胺酶NDM-I和VIM-2的快速诊断。[0005]为了克服现有技术的不足，本发明采用切换筛选法筛选出了一种可高亲和力结合NDM-I和VM-2的核酸适体APNV。核酸适体是通过体外筛选技术SELEX指数富集的配体系统进化技术，SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment从DNARNA文库中筛选出来的能特异结合革G标的单链寡聚核苷酸片段（ssDNA或ssRNA，即核酸适体Aptamer。核酸适体的革El标既可以是生物大分子，如结构蛋白、酶等，也可以是化合物，甚至是金属离子。核酸适体与靶标之间的结合具有高特异性和高亲和力识别的特点。此外，核酸适体还具有易于制备和保存、稳定性强、免疫原性低等特点。本发明的核酸适体与NDM-I和VM-2结合的亲和力与抗体相比较高，能够快速检测出NDM-I和或VM-2耐药细菌，且特异性高、稳定性强、成本低、易于制备和使用，具有开发成为临床快速检测试剂的广泛应用前景。发明内容[0006]本发明的目的之一在于提供一种易于制备的能够同时识别NDM-I和VIM-2的核酸适体APNV，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0007]本发明的目的之二在于提供一种能同时识别NDM-I和VM-2的核酸适体的筛选方法。[0008]本发明的目的之三在于提供一种含有上述核酸适体APNV的试剂盒。[0009]本发明的目的之四在于提供一种上述核酸适体APNV在制备NDM-I和或V頂-2的检测试剂中的应用。[0010]本发明的目的之五在于提供一种上述核酸适体APNV在检测金属β-内酰胺酶耐药菌中的应用，优选金属β-内酰胺酶耐药菌为NDM-I和或V頂-2Ν耐药菌。[0011]本发明的目的由以下技术措施实现：[0012]本发明提供一种能够同时识别NDM-1和VIM-2的核酸适体APNV，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0013]本发明还提供一种上述核酸适体APNV的筛选方法，包括以下步骤：[0014]1.蛋白质的处理[0015]将牛血清白蛋白、NDM-I和V頂-2配制成浓度均为0.5mgml的溶液。将孔径为0.22μm的硝酸纤维素膜剪成边长为Icm的正方形，浸泡于筛选缓冲液溶液中过夜。于室温下，将处理后的硝酸纤维素膜浸泡于NDM-I或V頂-2溶液中，反应2h;取出硝酸纤维素膜，置于牛血清白蛋白溶液中封闭2小时。[0016]2.随机单链DNA文库的设计[0017]随机单链DNA文库是两端为已知的引物序列、中间为35个碱基的随机序列：5’_GCAATGGTACGGTACTTCC-N35-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA-3’，N35表示35个随机核苷酸。[0018]3.核酸适体的筛选[0019]1第一轮核酸适体筛选:NDM_1核酸适体的筛选[0020]A.随机单链DNA文库的预处理[0021]取步骤2的DNA文库DNA链数量为IXIO15于95°C加热变性IOmin后立即置于冰中15min以上，用筛选缓冲液稀释至所需体积。[0022]B.DNA文库与酶结合[0023]首先将吸附有NDM-I硝酸纤维素膜浸泡于将经过预处理后的随机单链DNA文库中，并于37°C缓慢颠倒混合温育45min，取出滤膜再用洗涤缓冲液连续洗涤10次，去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA。[0024]C·单链DNA的制备[0025]取步骤B处理后的滤膜，用灭菌后的剪刀剪碎后，加入超纯水200μ1，100°C水浴处理10min，12000g离心2min，取上清作为PCR模版，用第一引物和生物素标记的第二引物进行PCR扩增，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收，然后加入到链亲和素磁纳米磁颗粒中，室温下温育30miη后，在磁力架上静置5min，去掉上清，向链亲和素纳米磁颗粒中加入200molL的氢氧化钠溶液，使目的单链DNA脱离纳米磁颗粒;然后在磁力架上静置后，取上清，用200mmolL的盐酸调节pH值至6.8-7.2，所获得的单链DNA即可用于后续的筛选。[0026]2第一轮核酸适体筛选:V頂-2核酸适体的筛选[0027]将步骤A所获得的核酸适体按照步骤B中所述方法与VIM-2结合，并按照步骤C进行处理，获得单链DNA可用于后续的筛选。[0028]4.随克隆测序[0029]经过上述8轮筛选后，将筛选所获的PCR产物，克隆入T-A克隆载体，转化大肠杆菌DH5a，取阳性克隆进行测序，制备核酸适体单链DNA并检测亲和力，最终获得核酸适体APNV，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0030]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0031]1本发明采用SELEX技术筛选得到一种既能结合NDM-I又能结合VIM-2的高亲和力结合的核酸适体APNV，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。避免了传统抗体制备中动物实验过程，而直接从体外文库中选择，筛选的核酸适体没有免疫原性。并且可以大大缩短检测时间，能够应用于临床快速诊断，易于临床推广和使用，无需昂贵设备和复杂的检测实验条件。[0032]2本发明的核酸适体APNV具有高特异性和亲和力，靶分子类型没有特殊限制，筛选范围广泛，能够用于NDM-I和或VIM-2细菌的快速诊断或检测，具有较好的临床应用前景。[0033]3本发明的核酸适体APNV生产过程简单，成本低，无明显的毒性及过敏源性，而且核酸适体是一种DNA分子或者经过修饰后的RNA，其理化性质相当稳定，无需特殊条件即可以稳定保存。[0034]4单克隆抗体的分子量一般为160KD左右，而核酸适体的分子量介于4.95KD-29KD之间，与传统单克隆抗体相比，本发明的核酸适体较小，获得方便，合成的重现性好，通过化学合成和修饰可以增强其稳定性，且其与靶分子形成的复合物的解离平衡常数Kd—般都在纳摩尔级。附图说明[0035]图1为SPR检测核酸适体APNV与NDM-I和V頂-2的亲和力检测结果图。具体实施方式[0036]以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。[0037]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0038]实施例1核酸适体[0039]核酸适体APNV的核苷酸序列为：[0040]CATTACTTCCGGAAGAAATCCACAGGATTCAACTGSEQIDN0:1〇[0041]实施例2核酸适体的筛选方法[0042]1.主要试剂及缓冲液：[0043]1·1主要试剂:NDM-I和V頂-2酶蛋白；[0044]其他主要试剂:PCR产物纯化试剂盒购自Qaigen公司）、T_A克隆试剂盒及TaqDNA聚合酶购自宝生物大连有限公司）、牛血清白蛋bovinserumalbum，BSA、鲑鱼精DNA购自Sigma-Aldrich0[0045]1.2主要缓冲液及溶液[0046]Tris-HCl缓冲液：50mmolLTris-HCl，pH7.4;[0047]筛选缓冲液（selectionbuffer，SB:pH7·4的50mmolLTris-HCl含I%BSA、0.01%鲑鱼精DNA、100mmolLNaCl、lmmolLMgCl2、5mmolLKCl和0.05%Tween20;[0048]洗涤缓冲液：50mmolLTris-HCl含0.05%VVTween20，pH7.4;[0049]封闭缓冲液：即含有1%BSA和0.05%Tween20的PBS缓冲液。[0050]2.核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：[0051]2.1蛋白质的处理[0052]将牛血清白蛋白、NDM-I和V頂-2配制成浓度均为0.5mgml的溶液。将孔径为0.22μm的硝酸纤维素膜剪成边长为Icm的正方形，浸泡于筛选缓冲液溶液中过夜。于室温下，将处理后的硝酸纤维素膜浸泡于NDM-I或V頂-2溶液中，反应2h;取出硝酸纤维素膜，置于牛血清白蛋白溶液中封闭2小时。[0053]2.2随机单链DNA文库的设计[0054]随机单链DNA文库是两端为已知的引物序列、中间为35个碱基的随机序列：5’_GCAATGGTACGGTACTTCC-N35-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA-3’，N35表示35个随机核苷酸。[0055]2.3核酸适体的筛选[0056]2.3.1第一轮核酸适体筛选:NDM-1核酸适体的筛选[0057]2.3.1.1随机单链DNA文库的预处理[0058]取步骤2.2的DNA文库DNA链数量为IXIO15于95°C加热变性IOmin后立即置于冰中15min以上，用筛选缓冲液稀释至所需体积。[0059]注:筛选缓冲液中含有的BSA可以与文库中可能与BSA结合的核酸适体结合，从而避免与硝酸纤维素膜上的BSA结合，而避免与BSA结合的核酸适体结合而被保留下来。[0060]2.3.1.2DNA文库与酶结合[0061]首先将吸附有NDM-I硝酸纤维素膜浸泡于将经过预处理后的随机单链DNA文库中，并于37°C缓慢颠倒混合温育45min，取出滤膜再用洗涤缓冲液连续洗涤10次，去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA。[0062]2·3·1·3单链DNA的制备[0063]取步骤2.3.1.2处理后的滤膜，用灭菌后的剪刀剪碎后，加入超纯水200μ1，100°C水浴处理10min，12000g离心2min，取上清作为PCR模版，用第一引物和生物素标记的第二引物进行PCR扩增，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收，然后加入到链亲和素磁纳米磁颗粒中，室温下温育30min后，在磁力架上静置5min，去掉上清，向链亲和素纳米磁颗粒中加入200molL的氢氧化钠溶液，使目的单链DNA脱离纳米磁颗粒;然后在磁力架上静置后，取上清，用200mmolL的盐酸调节pH值至6.8-7.2，所获得的单链DNA即可用于后续的筛选。[0064]2.3.2第一轮核酸适体筛选:V頂-2核酸适体的筛选[0065]将2.2所获得的核酸适体按照2.3.1.2中所述方法与VIM-2结合，并按照步骤2.3.1.3进行处理，获得单链DNA可用于后续的筛选。[0066]4.4克隆测序[0067]经过8轮筛选后，将筛选所获的PCR产物，克隆入T-A克隆载体，转化大肠杆菌DH5a，取阳性克隆进行测序，制备核酸适体单链DNA并检测亲和力，最终获得核酸适体APNV，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0068]实施例3核酸适体APNV与OdDHLS的亲和力解离平衡常数Kd的检测[0069]1·SPR技术检测[0070]采用strepavidin芯片，在Biacore3000上进行表面等离子共振检测，检测温度为25°C;芯片用30μ1IMNaCl含50mMNaOH洗涤两次，然后在第一通道注射溶于工作缓冲液50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4,0.005%VVTween20的IOnM生物素化的核酸适体，上样流速为5ylml，第二通道同时注射工作缓冲液，作为对照。[0071]将NDM-I和VM-2蛋白质溶于工作缓冲液（10至500ηΜ后上样，上样时间为120s，滞留300s，然后洗涤五次;芯片表面用溶于工作缓冲液的30μ1的5M尿素进行再生，用仪器自带的软件进行KdPKa分析。[0072]核酸适体APNV对NDM-I和V頂-2亲和力的SPR检测结果如说明书附图1所示。[0073]核酸适体APNV对OdDHLS亲和力的SPR检测结果表明，本发明的核酸适体APNV与NDM-I和VM-2的亲和力的解离平衡常数Kd分别为8.7ηΜ和llnM，证明了本发明的核酸适体APNV可高亲和力同时结合NDM-I和VIM-2。[0074]最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

权利要求：1.一种可同时识别NDM-I和VM-2的核酸适体APNV，其特征在于:所述核酸适体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的核酸适体APNV的筛选方法，其特征在于：利用SELEXSystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment技术从DNA文库中筛选，还包括NDM-I核酸适体和V頂-2核酸适体交替筛选步骤。3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于:所述DNA文库是随机单链DNA文库，所述随机单链DNA文库的两端为已知的引物序列、中间为35个碱基的随机序列：5’_GCAATGGTACGGTACTTCC-N35-CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA-3’，N35表示35个随机核苷酸。4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于:所述NDM-I核酸适体和VIM-2核酸适体交替筛选步骤如下：⑴随机单链DNA文库的预处理:将所述DNA文库于95°C加热变性IOmin后立即置于冰中15min以上，用筛选缓冲液稀释至所需体积；2DNA文库与酶结合:将吸附有NDM-I或V頂-2的硝酸纤维素膜浸泡于将经过预处理后的随机单链DNA文库中，并于37°C缓慢颠倒混合温育45min，取出滤膜再用洗涤缓冲液连续洗涤10次，去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA;3单链DNA的制备:取步骤2处理后的滤膜，用灭菌后的剪刀剪碎后，加入超纯水200μΐ，100°C水浴处理IOmin，12000g离心2min，取上清作为PCR模版，用第一引物和生物素标记的第二引物进行PCR扩增，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收，然后加入到链亲和素磁纳米磁颗粒中，室温下温育30min后，在磁力架上静置5min，去掉上清，向链亲和素纳米磁颗粒中加入200molL的氢氧化钠溶液，使目的单链DNA脱离纳米磁颗粒;然后在磁力架上静置后，取上清，用200mmolL的盐酸调节pH值至6.8-7.2，所获得的单链DNA即可用于后续的筛选；所述NDM-I核酸适体及所述VM-2核酸适体的筛选分别经过步骤⑴至3，交替进行8轮筛选，获得可同时识别NDM-I和VIM-2的核酸适体。5.—种单链寡核苷酸，其特征在于:含有权利要求1所述的核酸适体APNV。6.权利要求1所述的核酸适体APNV在制备NDM-I和或VIM-2检测试剂中的应用。

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