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申请/专利权人：法国诗华大药厂

摘要：本发明涉及新的重组猪痘病毒以及它们在疫苗组合物中的用途。本发明的重组猪痘病毒对于IL18bp和TK基因来说是双重缺陷的，并包含克隆到缺陷型TK基因序列中的至少一个外源基因。本发明特别适合于生产猪疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种以对抗PCV2感染。

主权项：1.一种重组猪痘病毒rSPV，其至少具有第一和第二缺陷型病毒基因，其中所述第一缺陷型病毒基因是IL18bp基因，并且所述第二缺陷型病毒基因是胸苷激酶TK或锚蛋白重复序列蛋白ARP基因，其中所述缺陷型病毒基因是部分或完全缺失的基因。

全文数据：多价重组SPV技术领域本发明涉及新的重组猪痘病毒以及它们在疫苗组合物中的用途。本发明的重组猪痘病毒是双重缺陷的，并允许一种或多种外源基因序列在体内有效表达。本发明特别适合于生产猪疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种以对抗PCV2感染。背景技术在本领域中已提出将不同类型的病毒作为载体用于体内基因递送或肽表达。具体来说，已使用重组病毒例如痘病毒OgawaR.等，Vaccine,8:486-4901990、腺病毒HSU,K.H.等，Vaccine,12；607-6121994、杆状病毒以及疱疹病毒Shin,M.-F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:5867-58701984制备了表达至少一种相关抗原的兽医用疫苗。允许外源抗原基因表达的具体病毒载体的实例包括奥耶斯基氏病病毒伪狂犬病病毒；PRVVanZijlM.等，J.Virol.,65:2761-27651991、火鸡的疱疹病毒HVTMorganR.W.等，AvianDis.36:858-8701992和马立克氏病病毒MDV。基于疱疹病毒属的重组载体正在进行深入研究。然而，在本领域中，对可用于在体内表达重组肽或蛋白质的新的病毒载体产品，存在着需求。就此而言，痘病毒已被工程化改造以编码不同的多肽。痘病毒一旦从被感染细胞释放到血液中，可以感染其他细胞并因此潜在地引起表达水平提高。重组痘病毒已从不同类型的痘病毒包括牛痘病毒、痘苗病毒和猪痘病毒SPV生产。然而，到目前为止，SPV重组体基本上通过将外源基因序列克隆到被认为对SPV的存活非必需的遗传区域即TK区中来生产RichardW.Moyer,EladioVinuela,E.P.J.Gibbs,US5,651,9721997。申请人的PCTEP2015080468描述了IL-18结合蛋白IL18bp基因序列作为SPV中新的且非常有利的克隆位点。继续研究，本发明的发明人现在发现，其中IL18bp基因和至少TK或ARP基因两者都缺陷的双重缺陷的SPV，允许在体内高效并稳定地表达几种外源基因序列，可以在培养物中有效地增殖，并在体内毒性高度减弱。因此，这些双重缺陷的SPV表现出改进的性质，并且可用于生产用于治疗任何哺乳动物、特别是猪的治疗剂或疫苗。发明内容本发明涉及新的重组猪痘病毒以及它们用于基因递送和体内表达、特别是在疫苗组合物中的用途。本发明的重组猪痘病毒对于IL18bp基因和TK和或ARP基因两者来说是双重缺陷的。优选地，本发明的SPV含有一个或多个外源基因序列，其优选地被克隆到猪痘病毒的缺陷型TK、ARP或IL18bp基因区中。本发明特别适合于生产猪疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种以对抗PCV2感染。因此，本发明的第一个目的涉及一种重组猪痘病毒rSPV，其至少具有第一和第二缺陷型病毒基因，其中所述第一缺陷型病毒基因是IL18bp基因，并且所述第二缺陷型病毒基因是胸苷激酶TK或锚蛋白重复序列蛋白ARP基因。在特定实施方式中，本发明提供了包含缺陷型IL18bp基因和缺陷型TK基因的重组猪痘病毒SPV。在另一个特定实施方式中，本发明提供了包含缺陷型IL18bp基因和缺陷型ARP基因的重组猪痘病毒SPV。优选地，所述rSPV在每个所述靶缺陷型病毒基因序列中包含至少50pb、至少100pb、至少200pb或甚至至少300pb的缺失。此外，在优选实施方式中，所述rSPV还包含至少一个第一外源基因序列，其可以被放置在所述rSPV中的任何位置处，优选地代替所有或一部分所述缺失的病毒基因序列。在特定实施方式中，本发明的rSPV包含两个外源基因序列，第一个被插入以代替所述缺失的病毒IL18bp基因序列，第二个被插入以代替所述缺失的病毒TK或ARP基因序列。本发明的另一个目的在于一种核酸分子，其包含如上所定义的rSPV的基因组。本发明的另一个目的是包含本发明的rSPV或核酸分子的宿主细胞。本发明还提供了一种用于生产rSPV的方法，所述方法包括将如上所定义的核酸分子感染或引入到感受态细胞中并收集所述rSPV。本发明还涉及一种用于增殖rSPV的方法，所述方法包括用如上所定义的rSPV感染感受态细胞，并收集由所述细胞产生的rSPV。本发明还涉及一种组合物，优选为兽医组合物，其包含如上所定义的rSPV或如上所定义的细胞或如上所定义的核酸分子以及赋形剂。本发明的另一个目的是一种疫苗组合物，其包含如上所定义的rSPV或如上所定义的细胞或如上所定义的核酸分子、适合的赋形剂和任选地佐剂。本发明还涉及如上所定义的rSPV或细胞或核酸分子，其用于将治疗剂递送到猪或将肽或蛋白质接种到猪。本发明还涉及如上所定义的rSPV或细胞或核酸分子，其用于免疫或疫苗接种哺乳动物、优选为猪以对抗病原体。本发明还涉及一种用于疫苗接种哺乳动物、优选为猪以对抗病原体的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药如上所定义的rSPV或细胞或核酸分子。本发明还涉及一种用于使猪免疫的疫苗接种试剂盒，其包含下述组分：a.有效量的如上所定义的rSPV或疫苗，和b.用于将所述rSPV或疫苗给药到所述猪的装置。本发明可用于将任何外源基因序列递送到哺乳动物、特别是猪并表达。它特别适用于表达外源抗原以免疫或疫苗接种猪例如猪、仔猪、母猪。附图说明图1.中间质粒pSP91的构建方案。图2.同源质粒pSP911-Ess_ORF2cc和pSP911-ORF2cc的构建方案。图3.同源质粒pSP53-ORF2的构建方案。图4.同源质粒pSP72-ORF2的构建方案。图5.重组SPV的基因组结构的图示。图6.SVR14和SVR15体外传代的PCR检查。APCR结果。PCR使用引物组SP7450F和SP8552R进行。每个模板是SVR14和SVR15的体外传代+0或+15p的病毒DNA。在用于制造SVR12、SVR14或SVR15的转染时的各个转化质粒和pCR4-SPV60309574，被分别用于阳性对照PC或阴性对照NC的模板。分子量标志物是10kbM1和pHY。B亲本和rSPV即SVR14和SVR15的IL-18bp基因侧翼区的图示。黄色框是IL-18bp基因。图7.纯化的rSPV的蛋白质印迹分析将ESK-4细胞用野生型SPVwt、SVR1414或SVR1515感染。6天后，将细胞裂解液施加到15％SDS-PAGE，并使用大鼠抗ORF2抗体1:500、生物素偶联的山羊抗大鼠IgG第二抗体1:1000和ABC-ALPVecterstain进行蛋白质印迹分析。M：分子量标志物。图8.SVR16和17体外传代的PCR检查APCR结果。PCR使用引物组P05-8和P05-9进行。每个模板是SVR16和17体外传代+0p和+15p的病毒DNA。转化质粒pSP53-ORF2和pNZSP5描述在JP2003-111591A的实验3和图3中分别被用作阳性对照PC和阴性对照NC模板。分子量标志物是10kbM1和λHindIIIM2。B亲本和rSPV即SVR16和SVR17的ARP基因侧翼区的图示。图9.SVR20体外传代的PCR检查APCR结果。PCR使用两个引物组aSP7450F和SP8552R以及bSP55500F和SP56363R进行。每个模板是每个SVR20+0p或+15p的病毒DNA。每个质粒pCR4-SPV60309574N1或pCR4-SPV5424257617N2和pSP911-ORF2ccP1或pSP72-ORF2P2被用于阴性和阳性对照的模板。将a或b的PCR产物分别放置在2％或0.8％琼脂糖凝胶上。分子量标志物是10kbM1和pHYM2标志物。B野生型SPV和SVR20的TK基因侧翼区的图示。黄色框是TK基因。图10.纯化的rSPV的蛋白质印迹分析将ESK-4细胞用野生型SPVwt、SVR1414、SVR1515、SVR1616、SVR1717或SVR2020以0.1的M.O.I.感染。6天后，将细胞裂解液施加到15％SDS-PAGE，并使用大鼠抗ORF2抗体1:500、生物素偶联的山羊抗大鼠IgG第二抗体1:1000和ABC-ALPVecterstain进行蛋白质印迹分析。M：分子量标志物。图11.猪的注射位点处的红斑大小的转变。具体实施方式本发明涉及新的重组猪痘病毒及其用途。本发明的重组猪痘病毒对于猪痘病毒的IL18bp基因和选自TK和ARP基因的第二个基因来说是双重缺陷的，并优选地含有一个或多个外源基因序列。如实验部分中所示，这些双重缺陷的SPV载体允许持续且高效的基因表达。此外，本发明的rSPV是稳定的，并且可以在体内产生改善的免疫应答。此外，本发明的这些SPV载体是毒性高度减弱的。这是双重缺陷SPV病毒的第一份报告，并第一次证实了这些SPV可以表达外源基因序列，产生稳定、具有免疫原性和高产的重组SPV载体。本发明的rSPV可以含有超过一个外源基因序列，并且它们可以单独地或与其他重组病毒或抗原组合使用，以产生改进的疫苗。本发明特别适合于生产猪疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种以对抗PCV2感染。rSPV在本发明的情形中，重组猪痘病毒通常是指具有人工例如重组工程改造的基因组的猪痘病毒。具体来说，rSPV包括在基因组中含有外源遗传物质或序列的猪痘病毒。rSPV通常包含含有外源遗传物质的SPV基因组，其被包装在也可以含有外源蛋白或肽的SPV衣壳或包膜中。本发明的rSPV可以从任何SPV开始制备，例如任何天然存在的SPV或可以从保藏中心例如ATCC、CNCM等获得的任何SPV。优选地，本发明的rSPV从SPVkasza毒株VR-36317077-99分离株GeneBankAcc:AF410153.1或VTCCAVA121毒株GeneBankAcc:KJ725378.1产生。这些SPV可以从保藏中心或文库获得，或者可以从它们可公开获得的基因组序列来克隆。也可以从被感染动物分离其他的SPV分离株并将其用于制备本发明的rSPV。SPV或rSPV可以在任何适合的细胞中培养或维持或增殖。例如，SPV可以在胚胎猪肾细胞例如ESK-4细胞CL-184中培养、维持或增殖，所述细胞通常在37℃下，在5％CO2中，在增补有1％链霉素-青霉素Gibco，目录号15140-122和5％FBSGibco，目录号10437-028的Ham的F-12K培养基Gibco，目录号21127-022中培养。为了构建本发明的重组病毒，首先可以将所述SPV病毒在适合的宿主细胞中增殖，然后获得基因组DNA。随后，鉴定所述基因组DNA的IL18bp、TK和或ARP区并使其缺陷例如全部或部分缺失。随后或同时地，可以将外源基因序列或允许外源基因序列插入的克隆位点插入到所述基因组DNA中，任选地代替所述缺失的内源基因序列。由此获得的重组SPV基因组可用于通过按照常规技术转化适合的感受态细胞来生产rSPV。或者，可以产生穿梭载体，其含有侧翼带有与IL18bp、TK和或ARP基因区同源的序列并被放置在编码区中的外源基因序列或克隆位点。在SPV病毒或基因组存在下引入到感受态细胞中之后，所述穿梭载体与基因组之间的同源重组产生具有缺陷基因并含有外源基因序列的rSPV。在rSPV如上所述工程化改造后，它可以通过在任何感受态细胞上简单培养而容易地复制和增殖。SPV可以在胚胎猪肾细胞例如ESK-4细胞CL-184中培养、维持或增殖，所述细胞通常在37℃下，在5％CO2中，在增补有1％链霉素-青霉素Gibco，目录号15140-122和5％FBSGibco，目录号10437-028的Ham的F-12K培养基Gibco，目录号21127-022中培养。可以按照任何常规方法从病毒感染的细胞提取DNA。例如，可以将单层生长的细胞刮下然后离心以收集上清液。在将蛋白质在裂解缓冲液中变性并除去之后，可以用苯酚和或乙醇提取DNA。在本发明的情形中，“缺陷型”基因意味着部分或完全缺失的基因。更具体来说，含有缺陷基因的SPV是在所述基因的编码序列内含有至少20bp、优选地至少50bp、甚至更优选地至少100bp、更进一步优选地至少150bp、至少200bp或甚至至少300bp的缺失的SPV。病毒SPVDNA的IL18bp基因含有大约402bp，并且通常位于SPV基因组的7745-8146位核苷酸残基处。作为具体实例，在SPVkasza毒株VR-363中，IL18bp基因位于nt7745-8146处。IL18bp基因在任何SPV毒株中的准确位置可以使用常用知识、常规序列分析和或序列比对而容易地鉴定。病毒SPVDNA的TK基因含有大约543bp，并且通常位于SPV基因组的55625-56167位核苷酸碱基处。作为具体实例，在SPVkasza毒株VR-363中，TK基因位于nt55625-56167处。IL18bp基因在任何SPV毒株中的准确位置可以使用常用知识、常规序列分析和或序列比对而容易地鉴定。病毒SPVDNA的ARP基因含有大约1455bp，并且通常位于SPV基因组的137100-138554位核苷酸碱基处。作为具体实例，在SPVkasza毒株VR-363中，ARP基因位于nt137100-138554处。IL18bp基因在任何SPV毒株中的准确位置可以使用常用知识、常规序列分析和或序列比对而容易地鉴定。本发明的优选rSPV包含缺陷型IL18bp基因，其中内源IL18bp基因缺少至少50nt、优选地至少100nt、甚至更优选地至少150nt、至少200nt、至少250nt、至少300nt、更优选地320nt至380nt之间。本发明的具体且优选的rSPV含有IL18bp基因的至少nt100-200、甚至更优选地IL18bp基因的至少nt50-300例如IL18bp基因的nt31-382或nt19-369的缺失。本发明的优选rSPV还包含缺陷型TK基因，其中内源TK缺少至少50nt、优选地至少100nt、甚至更优选地至少150nt、至少200nt、至少250nt、至少300nt、更优选地至少400nt例如420nt至500nt之间。本发明的具体且优选的rSPV含有TK基因的至少nt100-300、甚至更优选地TK基因的至少nt70-450、甚至更优选地TK基因的至少nt60-500、例如TK基因的nt59-536的缺失。对于ARP基因来说，在本发明的rSPV中包含缺陷型ARP基因，所述内源ARP基因编码序列优选地缺少至少50nt、优选地至少100nt、甚至更优选地至少110nt。本发明的具体且优选的rSPV含有ARP基因的至少nt1150-1200、甚至更优选地ARP基因的至少nt1130-1220、甚至更优选地ARP基因的至少nt1116-1228的缺失。也可以进行覆盖ARP基因的800至1300bp之间的更大的缺失。在特定实施方式中，本发明的rSPV含有IL18bp基因的至少nt50-300的缺失和TK基因的至少nt70-450的缺失。在具体实施方式中，所述rSPV含有IL18bp基因的nt31-382或nt19-369的缺失和TK基因的nt59-536的缺失。在另一个特定实施方式中，本发明的rSPV含有IL18bp基因的至少nt50-300的缺失和ARP基因的至少nt11340-1220的缺失。在具体实施方式中，所述rSPV含有IL18bp基因的nt31-382或nt19-369的缺失和TK基因的nt1116-1228的缺失。在特定实施方式中，本发明的rSPV包含一个外源基因序列，其被插入以代替上述缺失区域之一。在另一个实施方式中，所述rSPV包含至少2个外源核酸，其各自位于选自上述缺失区域的不同位置中。本发明的rSPV的构建可以使用本身在本领域中已知的方法，遵照本申请中包含的指导和信息来进行。具体来说，专业技术人员可以使用已知方法例如突变、PCR、同源重组等将外源基因序列插入到TK、ARP或IL18bp序列中，代替全部或一部分内源序列。在特定实施方式中，通过重组DNA技术制备穿梭载体，其中将外源基因序列克隆成侧翼带有两个IL18bp或TK同源区。所述同源区通常各自含有IL18bp或TK基因序列的50-1000nt之间，允许特异性同源重组。所述穿梭载体可以从任何已知或常规的质粒、粘粒、噬菌体等制备，例如pBS质粒pBR322、pUC18、pUC19和pHC79。然后可以使用已知技术例如电穿孔、磷酸钙、基于脂质体的方法等，将所述穿梭质粒引入到SPV感染的细胞中。然后选择整合有所述外源基因序列的重组SPV病毒。可以核对它们的序列。然后可以将所述rSPV维持在任何适合的感受态细胞中。所述病毒可以维持在培养物中，或纯化并冷冻或冷冻干燥。本发明的rSPV的具体实例包含IL18bp基因中至少50nt的缺失和TK或ARP基因中至少50nt的缺失。本发明的优选病毒包含IL18bp基因中至少100nt的缺失和TK或ARP基因中至少100nt的缺失。本发明的更优选的病毒包含IL18bp基因中至少200nt的缺失和TK基因中至少200nt的缺失。本发明的另一种具体病毒是具有缺陷型病毒IL18bp基因并且不含编码外源基因序列的重组猪痘病毒rSPV。这种病毒是减毒的，并且可用于生产含有外源基因序列的rSPV，所述外源基因序列可以被插入到与IL18bp基因序列不同的区域中。外源基因序列所述外源基因序列可以是非天然存在于SPV基因组中或非天然存在于SPV基因组中的所述位置处的任何核酸序列或分子。外源基因序列通常包含编码mRNA、肽或多肽或蛋白质的核酸序列。所述外源基因序列可以例如编码各种不同类型的活性分子，例如抗原、佐剂、细胞因子、淋巴因子、生长因子、酶、标记物等。在优选实施方式中，所述外源基因序列编码来自于猪传染病的病原体的抗原肽、多肽或蛋白质抗原，最优选为来自于病毒、细菌、真菌或原生动物的抗原。在本发明的情形中，肽通常是指包含4至30个氨基酸的分子。多肽是包含超过30个氨基酸的任何氨基酸聚合物。术语多肽包括全长蛋白质。所述外源基因序列优选地编码病毒或病原体的肽或多肽例如糖蛋白、衣壳蛋白或其片段，所述病毒或病原体选自猪圆环病毒PCV1、PCV2、PCV2a、PCV2b、PCV2d、PCV3，胸膜肺炎放线杆菌Actinobacilluspleuropneunomia，腺病毒，甲病毒例如东部马脑脊髓炎病毒，结肠小袋纤毛虫Balantidiumcoli，支气管败血波氏杆菌Bordetellabronchiseptica，短螺旋体属物种优选为B.hyodyentheriae、毛肠短螺旋体B.pilosicoli、B.innocens，猪布鲁氏杆菌Brucellasuis优选为生物变种1、2和3，经典的猪瘟病毒，非洲猪瘟病毒，衣原体和嗜衣原体属物种且优选为C.pecorum和C.abortus，梭菌属物种优选为艰难梭菌Cl.difficile、产气荚膜梭菌Cl.perfringensA、B和C型、诺氏梭菌Cl.novyi、败血梭菌Cl.septicum、破伤风梭菌Cl.tetani，消化道和呼吸道冠状病毒，微小隐孢子虫Cryptosporidiumparvum，艾美球虫属物种Eimeriaspp，现在被命名为猪嗜血支原体Mycoplasmahaemosuis的Eperythrozoonissuis，红斑丹毒丝菌Erysipelothrixrhusiopathiae，大肠埃希氏杆菌Escherichiacoli，副猪嗜血杆菌Haemophilusparasuis优选为1、7和14亚型，血凝性脑脊髓炎病毒，lsosporasuis，日本脑炎病毒，Lawsoniaintracellulars，钩端螺旋体属物种Leptospiraspp.优选为澳大利亚钩端螺旋体Leptospiraaustralis、犬钩端螺旋体Leptospiracanicola、感冒伤寒型钩端螺旋体Leptospiragrippotyphosa、出血性黄疸钩端螺旋体Leptospiraicterohaemorrhagicae、问号钩端螺旋体Leptospirainterrogans、波蒙纳钩端螺旋体LeptospiraPomona和塔拉索夫钩端螺旋体Leptospiratarassovi，溶血曼海姆菌Mannheimiahaemolytica，分支杆菌属物种Mycobacteriumspp.优选为鸟分支杆菌M.avium、胞内分支杆菌M.intracellular和牛分支杆菌M.bovis，猪肺炎支原体Mycoplasmahyponeumoniae，细小病毒，多杀巴斯德菌Pasteurellamultocida，猪巨细胞病毒，猪细小病毒，猪生殖和呼吸系统综合征病毒，伪狂犬病病毒，轮状病毒，鹭山病毒，沙门氏菌属物种Salmonellaspp.优选为鼠伤寒沙门氏菌S.thyhimurium和猪霍乱沙门氏菌S.choleraesuis，葡萄球菌属物种Staphylococcusspp.优选为猪葡萄球菌S.hyicus，链球菌物种Streptococcusspp.优选为猪链球菌Strep.suis，猪巨细胞病毒，猪疱疹病毒，猪流感病毒，猪痘病毒，刚地弓形虫Toxoplasmagondii，水疱性口炎病毒或猪水疱疹病毒。在特别优选的实施方式中，所述外源基因序列编码PCV2抗原，特别是PCV2蛋白或肽，甚至更特别是PCV2衣壳例如ORF2蛋白或肽。所述外源基因序列可以含有转录启动子以允许或提高被编码的mRNA或多肽的表达。所使用的启动子可以是合成或天然启动子，包括猪痘病毒启动子、痘病毒启动子或源自于不同病毒或细胞的启动子，例如源自于真核或原核生物体的启动子。启动子的具体实例包括痘苗病毒7.5-kD启动子P7.5kDavisonA.J.等，J.Mol.Biol.,2104:749-691989、11-kD启动子P11kBertholet等，Proc.Nat.Acad.Sci.,82:2096-21001985或28-kD启动子P28kWeirJ.P.&MossB.,J.Virol.61:75-801987或人工合成的痘病毒启动子Ps、疱疹病毒的胸苷激酶启动子RossL.J.,Gen.Virol.74:371-3771993、HVT或MDV的gB蛋白启动子同上、人巨细胞病毒HCMV的IE启动子Alting-MessM.A.,NucleicAcidsRes.,17:94941989、SV40启动子GunningP.,Proc.Natl.Acad.Sci.,84:4931-48351987、β-肌动蛋白启动子同上，以及KostA.T.,NucleicAcidsRes.,11:8287-83011983、β-球蛋白启动子SpitznerJ.R.,NucleicAcidsRes.,18:1-111990、劳斯肉瘤病毒的LTR启动子FiekA.等，NucleicAcidsRes.,20:17851992等。此外，也可以使用SPV的结构蛋白或必需基因的启动子。本发明的rSPV可以含有几个外源基因序列，其位于相同的克隆区中和或不同克隆位点中。在特定实施方式中，本发明的rSPV包含至少2个外源基因序列，其编码两种不同抗原来自于相同或不同病原体。就此而言，在另一个特定实施方式中，本发明的rSPV至少包含编码PCV2抗原的外源基因序列和编码不同抗原的外源基因序列。在另一个特定实施方式中，本发明的rSPV包含编码抗原的外源基因序列和编码佐剂或细胞因子的外源基因序列。在另一个特定实施方式中，本发明的rSPV包含至少两个外源基因序列，其各自编码PCV2抗原，特别地，每个基因序列编码ORF2蛋白或肽，其可以是相同或不同的。就此而言，本发明的另一个实施方式涉及一种重组病毒，其包含至少两个外源基因序列，各自编码PCV2ORF2蛋白或肽，其中每个所述外源基因序列含有不同的细胞寻址信号，允许所述PCV2ORF2蛋白或肽在细胞的不同区室中表达。具体来说，在优选实施方式中，所述外源基因序列之一编码细胞质PCV2ORF2蛋白或肽，另一个编码暴露在细胞表面处的PCV2ORF2蛋白或肽细胞膜外表达。事实上，本发明显示，PCV2ORF2蛋白或肽抗原在两个不同细胞区室中的共表达在体内产生更强的免疫应答，允许更好地保护所述动物。在特定实施方式中，ORF2蛋白或肽的细胞膜寻址使用源自于痘苗病毒的B5R基因的细胞膜寻址肽来实现，正如在WO2014167060中所描述的。或者，也可以考虑其他细胞寻址序列。在特定实施方式中，本发明涉及一种rSPV，其包含至少两个外源基因序列，各自编码PCV2抗原、特别是ORF2蛋白或肽，其中一个外源基因序列位于病毒基因组中代替缺失的病毒IL18bp基因序列，一个外源基因序列位于病毒基因组中代替缺失的病毒TK或ARP基因序列，并且此外其中所述外源基因序列之一允许所述PCV2抗原的细胞质表达，另一个所述外源基因序列允许所述PCV2抗原的细胞膜暴露。在本发明的多价rSPV中，所述至少两个外源基因序列可以在相同或不同的启动子控制之下，并且方向相同或相反。核酸分子本发明还涉及包含本发明的rSPV的基因组的核酸分子。本发明的核酸分子可以是双链或单链的DNA或RNA。单链DNA或RNA可以是编码链，也被称为有义链，或者它可以是非编码链，也被称为反义链。本发明还涉及这些核酸分子的变体或类似物，例如与其具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或更高序列同一性的分子。两个核酸序列之间的同源性程度，可以利用本领域中已知的计算机程序来确定，例如提供在GCG程序包中的GAPProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8,August1996,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711Needleman,S.B.和Wunsch,CD.,1970,JournalofMolecularBiology,48,443-453。使用GAP和下述用于DNA序列比较的设置：GAP生成罚分为5.0，GAP延伸罚分为0.3。可以使用可作为GCG程序包的一部分获得的Pileup比对软件，使用例如间隙生成罚分为5和间隙宽度罚分为0.3的缺省设置，将核酸分子彼此对齐。用于确定给定核酸分子是否杂交到指定核酸的适合的实验条件，可以包括将含有待检查核酸的相关样品的滤膜在5xSSC中预浸泡10分钟，并将所述滤膜在5xSSC、5xDenhardt's溶液、0.5％SDS和100μgml变性的超声处理的鲑鱼精子DNA的溶液中预杂交，然后按照在Sambrook等中描述的杂交方法，在含有浓度为10ngml的P-dCTP标记的探针的相同溶液中，在大约45℃下杂交12小时1989；《分子克隆实验指南》MolecularCloning,ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbour,NewYork。然后将所述滤膜在2xSSC、0.5％SDS中，在至少55℃低严紧性、至少60℃中严紧性、至少65℃中高严紧性、至少70℃高严紧性或至少75℃非常高严紧性下清洗两次，每次30分钟。杂交可以通过将所述滤膜暴露于x-射线胶片来检测。符合本发明的核酸分子可以以核酸分子本身例如裸露的核酸分子、载体、病毒或宿主细胞等的形式提供。载体包括含有本发明的核酸分子的表达载体。宿主细胞在本发明的另一个实施方式中，提供了用符合本发明的核酸或rSPV转化的宿主细胞。这些细胞可以产生本发明的rSPV。适合的宿主细胞的实例对于本领域技术人员来说是已知的，或者可以由本领域技术人员容易地选择。宿主细胞优选为真核细胞例如哺乳动物例如猪真菌例如酿酒酵母、毕赤酵母、曲霉、镰孢菌、昆虫和植物细胞。宿主细胞的具体实例是猪肾细胞，例如ESK-4细胞CL-184。疫苗组合物和方法当在本文中使用时，术语“疫苗”包括可用于在动物例如猪中引起、刺激或放大针对病原体的免疫应答的任何组合物。本发明的疫苗的具体实例是能够引起或刺激或放大针对PCV2病毒的免疫力的组合物。在本发明的疫苗中，所述至少一个外源基因序列将编码抗原或佐剂。术语“免疫”包括将免疫原递送到对象的过程。免疫可以例如能够获得持续的高水平的抗体和或细胞应答，在后者中T-淋巴细胞可以杀死或抑制被免疫的非人类动物例如猪中的病原体，所述应答针对所述动物先前已经暴露到的病原体或抗原。本发明的疫苗包含在可药用介质中的免疫有效量的如上所述的rSPV或核酸或细胞。在实践中，免疫有效剂量所需的准确量可以随着对象而变，取决于多种因素例如所述对象的年龄和总体状况、所述制剂的性质和给药方式。适合的“有效量”可以由本领域普通技术人员使用仅仅是常规的实验就可以确定。例如，在本领域中已知在非人类动物对象的体重、疫苗的浓度和其他常见因素的基础上，确定或滴定适合的疫苗剂量以找出最低有效剂量的方法。在典型的实施方式中，所述疫苗包括10至10,000,000TCID50之间、优选地100至1,000,000TCID50之间、甚至更优选地1,000至100,000TCID50之间的本发明的rSPV的单一剂量。TCID50是指中值组织培养物感染剂量，即在50％的接种的细胞培养物中产生病理性变化的病毒的量。引发适合的免疫应答的疫苗的剂量、其中的组分的浓度和疫苗给药的时间安排，可以通过多种方法来确定，例如通过血清的抗体滴定例如通过ELISA和或血清中和测定分析和或通过免疫接种激惹评估。取决于给药途径，疫苗可以包含本身被本领域普通技术人员已知的其他成分，例如可药用载体、赋形剂、稀释剂、佐剂、冷冻干燥稳定剂、润湿或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂或防腐剂。可药用载体、赋形剂或稀释剂的实例包括但不限于去矿质水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油类例如花生油、落花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮；矿物油例如轻液体石蜡油或重液体石蜡油；鲨烯；纤维素衍生物例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐或羟丙基甲基纤维素；短链烷醇例如乙醇或异丙醇；短链芳烷醇；短链聚亚烷基二醇或短链亚烷基二醇例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；卡拉胶；黄芪胶或阿拉伯树胶；以及凡士林。通常，所述一种或多种载体以重量计形成所述疫苗组合物的10％至99.9％，并且可以通过常规方法，使用本领域中已知的试剂例如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、它们的混合物等来进行缓冲。佐剂的实例包括但不限于水包油乳液、氢氧化铝明矾、免疫刺激性复合物、非离子型嵌段聚合物或共聚物、细胞因子如IL-1、IL-2、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等、皂苷、单磷酰脂质AMLA、胞壁酰二肽MDP等。其他适合的佐剂包括例如硫酸铝钾、从大肠埃希氏杆菌Escherichiacoli分离的热不稳定或热稳定肠毒素、霍乱毒素或其B亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐剂等。基于毒素的佐剂例如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素，可以在使用之前例如通过用甲醛处理来失活。冷冻干燥稳定剂的实例可以是例如碳水化合物如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖、蛋白质例如白蛋白或酪蛋白及其衍生物。疫苗可以包含来自于几种病原体的抗原，所述病原体例如PCV2，胸膜肺炎放线杆菌Actinobacilluspleuropneunomia，腺病毒，甲病毒例如东部马脑脊髓炎病毒，结肠小袋纤毛虫Balantidiumcoli，支气管败血波氏杆菌Bordetellabronchiseptica，短螺旋体属物种优选为B.hyodyentheriae、毛肠短螺旋体B.pilosicoli、B.innocens，猪布鲁氏杆菌Brucellasuis优选为生物变种1、2和3，经典的猪瘟病毒，非洲猪瘟病毒，衣原体和嗜衣原体属物种且优选为C.pecorum和C.abortus，梭菌属物种优选为艰难梭菌Cl.difficile、产气荚膜梭菌Cl.perfringensA、B和C型、诺氏梭菌Cl.novyi、败血梭菌Cl.septicum、破伤风梭菌Cl.tetani，消化道和呼吸道冠状病毒，微小隐孢子虫Cryptosporidiumparvum，艾美球虫属物种Eimeriaspp，现在被命名为猪嗜血支原体Mycoplasmahaemosuis的Eperythrozoonissuis，红斑丹毒丝菌Erysipelothrixrhusiopathiae，大肠埃希氏杆菌Escherichiacoli，副猪嗜血杆菌Haemophilusparasuis优选为1、7和14亚型，血凝性脑脊髓炎病毒，lsosporasuis，日本脑炎病毒，Lawsoniaintracellulars，钩端螺旋体属物种Leptospiraspp.优选为澳大利亚钩端螺旋体Leptospiraaustralis、犬钩端螺旋体Leptospiracanicola、感冒伤寒型钩端螺旋体Leptospiragrippotyphosa、出血性黄疸钩端螺旋体Leptospiraicterohaemorrhagicae、问号钩端螺旋体Leptospirainterrogans、波蒙纳钩端螺旋体LeptospiraPomona和塔拉索夫钩端螺旋体Leptospiratarassovi，溶血曼海姆菌Mannheimiahaemolytica，分支杆菌属物种Mycobacteriumspp.优选为鸟分支杆菌M.avium、胞内分支杆菌M.intracellular和牛分支杆菌M.bovis，猪肺炎支原体Mycoplasmahyponeumoniae，细小病毒，多杀巴斯德菌Pasteurellamultocida，猪巨细胞病毒，猪细小病毒，猪生殖和呼吸系统综合征病毒，伪狂犬病病毒，轮状病毒，鹭山病毒，沙门氏菌属物种Salmonellaspp.优选为鼠伤寒沙门氏菌S.thyhimurium和猪霍乱沙门氏菌S.choleraesuis，葡萄球菌属物种Staphylococcusspp.优选为猪葡萄球菌S.hyicus，链球菌物种Streptococcusspp.优选为猪链球菌Strep.suis，猪巨细胞病毒，猪疱疹病毒，猪流感病毒，猪痘病毒，刚地弓形虫Toxoplasmagondii，水疱性口炎病毒和或猪水疱疹病毒。本发明的疫苗组合物可以是液体制剂例如水性溶液，油包水或水包油乳液，糖浆，酏剂，酊剂，用于肠胃外、皮下、真皮内、肌肉内或静脉内给药例如可注射给药的制备物例如无菌悬液或乳液。这些制剂在本领域中是已知的，并且通常通过将抗原和其他常用添加剂溶解在适合的载体或溶剂系统中来制备。液体制剂还可以包括含有悬浮或乳化剂的悬液和乳液。给药途径可以是经皮、通过粘膜给药或通过肠胃外途径真皮内、肌肉内、皮下、静脉内或腹膜内。本发明的疫苗可以方便地鼻内、透皮即施用在皮肤表面上或皮肤表面处用于系统性吸收、肠胃外、眼部等给药。肠胃外给药途径包括但不限于肌肉内、静脉内、腹膜内途径等。本发明的疫苗可以作为单一剂量或在重复剂量中给药。本发明的疫苗可以单独给药，或者可以与一种或多种其他组合物例如其他猪免疫原性或疫苗组合物同时或顺序给药。在所述组合物在不同时间给药的情况下，所述给药在时间上可以彼此分开或重叠。本发明还涉及在非人类哺乳动物例如猪中免疫或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给药如上所述的rSPV或核酸或细胞或疫苗。本发明的疫苗优选地被给药到猪、成年猪，但也给药到幼猪、仔猪或妊娠母猪。妊娠母猪的疫苗接种是有利的，因为它可以通过母体抗体的传播将被动免疫提供给新生猪。所述猪可以小于7、6、5、4、3、2或1周龄；1至6周龄；2至5周龄或3至4周龄。理想情况下，所述疫苗被给药到尚未暴露于所述病原体的对象。本发明还提供了一种容器，其包含免疫有效量的如上所述的rSPV、核酸、细胞或疫苗。本发明还提供了包含任选地无菌容器的疫苗接种试剂盒，所述容器包含免疫有效量的所述疫苗，用于将所述疫苗给药到动物的装置，以及任选地说明手册，其包括给药所述免疫有效量的组合物以治疗和或预防传染病的信息。PCV2疫苗本发明特别适合于PCV2感染和相关疾病的治疗预防性、治愈性。目前开发的PCV2疫苗例如Merial、CircoFLEXBoehringerlngelheimVetmedica或是失活的PCV2疫苗或亚单位疫苗。PCV2亚单位疫苗通常使用通过PCV2A的ORF基因的重组表达产生的纯化的重组PCV2A衣壳蛋白。就此而言，由PCV2分离株Imp1011的ORF2编码的蛋白质已在EP1741785中报道。由PCV2分离株PCV2Rm的ORF2编码的蛋白质已在WO2010061000中报道。由PCV2分离株412的ORF2编码的蛋白质已在EP1816200中报道。由另一种PCV2分离株的ORF2编码的另一种蛋白质已在EP1036180或EP2225367中报道。改进的合成的ORF2类型的蛋白已描述在WO2013030320和WO2014167060中。在特定实施方式中，本发明涉及如上所定义的rSPV，其中所述外源基因序列编码PCV2抗原，更优选为PCV2蛋白、多肽或肽。在更优选实施方式中，本发明涉及如上所定义的rSPV，其中所述外源基因序列编码PCV2ORF2多肽或其片段。在特定实施方式中，所述ORF2选自PCV2分离株Imp1011、PCV2Rm或412的ORF2，或与这些蛋白质具有至少80％序列同一性的ORF2，或它们的包含其至少10个、15个、更优选地至少20个连续氨基酸残基的免疫原性片段。在另一个特定实施方式中，本发明涉及包含至少两个外源基因序列的rSPV，每个外源基因序列编码PCV2抗原、特别是ORF2蛋白或肽，其中一个外源基因序列位于病毒基因组中代替缺失的病毒IL18bp基因序列，一个外源基因序列位于病毒基因组中代替缺失的病毒TK或ARP基因序列，并且此外其中所述外源基因序列的一个允许所述PCV2抗原的细胞质表达，所述外源基因序列的另一个允许所述PCV2抗原的细胞膜暴露。在一个实施方式中，所述rSPV包含至少两个外源基因序列，其各自编码来自于不同基因型、优选地来自于PCV2b和PCV2d的ORF2蛋白或肽。本发明的另一方面涉及在非人类哺乳动物中治疗和或预防PCV2相关疾病的方法，以及以及免疫或疫苗接种非人类哺乳动物对象例如猪、母猪、仔猪以对抗PCV2感染的方法，所述方法包括向所述动物对象给药如上所定义的rSPV、核酸、细胞或疫苗组合物。PCV2感染或相关疾病尤其包括断奶后多系统衰竭综合征PMWS、猪皮炎和肾病综合征PDNS、猪呼吸道疾病综合征PRDC、生殖系统障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性表皮炎、坏死性淋巴结炎和先天性震颤。优选地，非人类动物对象例如猪受到一定程度保护，其中PCV2感染的一种至所有的不利生理症状或影响被显著减轻、改善或完全防止。在一个实施方式中，本发明的疫苗组合物被给药到对PCV2感染易感或以其他方式具有PCV2感染的风险的猪，以提高所述对象自身的免疫应答能力。优选地，所述对象是需要疫苗接种以对抗断奶后多系统衰竭综合征PMWS和或猪皮炎和肾病综合征PDNS的猪。本发明的其他方面和优点将在后面的实验部分中公开，所述实验部分阐明了要求保护的发明。实施例实施例1用于制造重组SPV的质粒的构建1构建pSP91图1SPV基因组DNA如下制备：SPVkasza毒株VR-363和胚胎猪肾细胞ESK-4细胞CL-184可以从美国典型培养物保藏中心AmericanTypeCultureCollectionATCC购买。所述ESK-4细胞常规地在37℃下，在5％CO2中，在增补有1％链霉素-青霉素Gibco，目录号15140-122和5％FBSGibco，目录号10437-028的Ham的F-12K培养基Gibco，目录号21127-022中培养。对于SPV基因组DNA制备来说，将225cm2培养瓶中合生的ESK-4细胞用SPV感染并温浴6天，直至细胞显示出100％的细胞病变效应CPE。然后通过将细胞刮擦到培养基中并以1300rpm离心5min来收集被感染的细胞。倾倒出培养基，将细胞沉淀物轻柔地重悬浮在2ml磷酸盐缓冲盐水PBS：每升H2O1.5gNa2HPO4，0.2gKH2PO4，0.8gNaCl和0.2gKCl中，并进行两次连续的冻融。然后通过在4℃下以3000rpm离心5min除去细胞碎片。然后通过在4℃下以20,000xg离心20min，沉积存在于上清液中的SPV病毒粒子。然后将得到的沉积物用10mMTrispH7.5悬浮。然后从所述SPV病毒粒子，通过用裂解缓冲液20mMTris，pH9，0.1MNaCl2，5mMEDTA，0.1％SDS，0.2mgml蛋白酶K悬浮并在60℃温浴5min，来提取SPV基因组DNA。进行两次苯酚：氯仿1:1抽提，通过添加2倍体积的乙醇来沉淀样品并离心。倾倒出上清液，将沉积物SPVDNA空气干燥并在4℃下在10mMTrispH7.5、1mMEDTA中重新水化。通过聚合酶链反应PCR克隆SPV基因组中白介素18结合蛋白IL-18bp基因的侧翼区。SEQIDNO：1和2中示出的两个引物合成的寡核苷酸SP6030F和SP9574R购自TakaraBio。PCR反应以SPVDNA为模板，使用LATaq聚合酶TakaraBio和引物组SP6030F和SP9574R，按照生产商的流程来进行。SEQIDNO：1：CGAATTCATTCCTTTATCTTTASEQIDNO：2：GGAACTACGTTATACGATCAT扩增的约3.5kbp的DNA通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来确认，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒Qiagen从所述凝胶纯化。将所述纯化的DNA片段按照生产商的流程克隆到pCR4-TOPO载体Invitrogen中。挑取12个白色的氨苄青霉素抗性转化子，并在含有50μgml氨苄青霉素的LB培养基中生长，使用QuickLyse小量制备试剂盒Qiagen制备每个质粒。将每个质粒用ScaI消化，并选择两种候选质粒插入DNA的两种方向。然后使用染料终止物循环测序试剂DTCS和CEQ2000XL测序仪BeckmanCoulter对它们的插入DNA进行测序。候选质粒之一pCR-SPV60309574#1被确认为它含有SPV基因组DNAGeneBankAcc:NC_003389的6,030nt至9,574nt的DNA片段，并被用作基础质粒图1。接下来，使用pCR-SPV60309574#1作为模板，并使用两种引物组1SEQIDNO：3和4或2SEQIDNO：5和6进行PCR突变，以缺失一部分IL-18bp基因nt31-382并引入多个限制性酶位点。SEQIDNO：3：TTCGCCCTTACGGTACCATTCCTTTATCTTTATAAACGSEQIDNO：4：CTATAATATTAAATAAGCTTTATGGAGTTGTTTAAATACSEQIDNO：5：CACACGATAACACTGCAGTCCACATATTACGGTTCSEQIDNO：6：GCCGCGAATTCGCCCTCGAGGAGCTCACTACG将每种PCR产物施加到0.8％琼脂糖凝胶电泳，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。将纯化的、使用引物组SEQIDNO：3和4通过PCR扩增的DNA片段用两种限制性酶KpnI和HindIII消化，并与用同样的限制性酶切开的pBluescriptKS+Stratagene连接。将得到的质粒pBS-9LKpn..Hin图1用SacI和PstI消化，并将用同样的限制性酶切开的、使用引物组SEQIDNO：5和6通过PCR扩增的DNA片段插入到其中。得到的质粒被命名为pSP90图1。在pSP90的多限制性酶位点中的EcoRI与HindIII位点之间，用通过将两个合成的SEQIDNO：7和8的DNA寡核苷酸退火而制备的寡核苷酸衔接子替换。得到的质粒被命名为pSP91图1。SEQIDNO：7：AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCASEQIDNO：8：AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC2构建pSP911-ORF2cc和pSP911-Ess_ORF2cc图2将pSP91的KpnI与PstI之间的序列用SEQIDNO：9中示出的合成衔接子替换，以在其中插入痘苗病毒11-kD启动子，所述启动子据报道是强的晚期启动子A.J.Davison和B.Moss.J.Mol.Biol.210,771-784,1989。得到的质粒被命名为pSP911图2。SEQIDNO：9：GGTACCGAGCTCGGTAGCCCGGGCCATGGTAGATCCTCTAGAGGATCCAATTCATTTATAGCATAGAAAAAAACAAAATGAAATTCTACTATATTTTCTGCAG合成编码PCV2的ORF2的外源基因序列：制备含有PCV2的密码子改变的ORF2的第一个序列被命名为ORF2cc。该序列允许细胞质表达。制备含有PCV2的同样的密码子改变的ORF2，但被修饰以进一步包含细胞膜寻址序列的另一个序列被命名为Ess_ORF2cc。该序列允许被编码的多肽的细胞膜暴露。合成的ORF2cc和Ess_ORF2cc的序列分别为SEQIDNO：10和11。SEQIDNO：10：ATGACCTACCCTAGAAGAAGATATAGGAGGCGGAGGCATCGGCCACGGAGTCACCTGGGACAAATTCTGCGGAGAAGGCCATGGTTGGTGCATCCAAGACATAGATATAGGTGGAGGAGAAAGAACGGAATCTTTAATACAAGACTGTCTAGAACTTTTGGGTACACCGTGAAAAGAACAACCGTGAGGACCCCATCTTGGGCCGTTGATATGATGAGGTTTAACATCAACGATTTCTTCCCTCCTGGGGGAGGATCTAATCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTATTATAGGATCAGGAAAGTGAAAGTGGAGTTTTGGCCATGTAGCCCAATTACTCAAGGAGATAGAGGTGTTGGATCTAGCGCCGTGATCCTGGACGACAATTTCGTGACCAAAGCAACCGCACTGACTTACGATCCTTACGTGAATTATTCTAGCAGACACACTATTACTCAACCATTTAGCTATCACAGCAGATATTTCACTCCTAAGCCAGTGCTGGACAGCACCATCGACTATTTTCAGCCTAATAATAAGAGGAATCAACTTTGGCTTAGGCTTCAGACCGCCGGGAACGTGGATCACGTGGGATTGGGAACCGCATTTGAGAATTCTATTTATGATCAAGAGTATAACATTAGAGTGACTATGTACGTGCAGTTTAGGGAGTTCAACCTGAAAGATCCACCTCTGAATCCATAASEQIDNO：11：ATGAAAACGATTTCCGTTGTTACGTTGTTATGCGTACTACCTGCTGTTGTTTATTCAACATGTACTGTACCCACTATGAATAACGCTAAATTGACGTCTACCGAAACATCGTGGAAAAAAGAGAAAGGAGTCTTGAACACCAGATTGTCTAGAACCTTCGGTTACACCATTAAGAGAACCACCGTCAAAACCCCATCTTGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACATCAACGATTTCGTCCCACCTGGTGGTGGATCAAACCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAAGTCAAAGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCTATTACTCAGGGTGATAGAGGAGTTGGATCAACTGCCGTCATCTTGGATGACAACTTCGTCACTAAGGCTACTGCCTTGACCTACGATCCTTACGTCAATTACTCTAGTAGACACACCATCACCCAACCATTCTCATACCATTCCAGATACTTCACTCCAAAACCTGTCTTGGACTCAACCATCGATTACTTTCAACCAAACAACAAGAGAAACCAATTGTGGTTGAGATTGCAAACTGCCGGTAACGTCGATCATGTCGGATTGGGAACCGCCTTCGAAAACTCCAAATACGACCAGGAGTACAACATTAGAGTCACCATGTACGTCCAATTCAGAGAGTTCAACTTGAAGGACCCACCATTGAACCCATAA将这些在5'或3'端偶联有BamHI或SalI位点的合成的基因——ORF2cc和Ess_ORF2cc用BamHI和SalI消化，并插入到用BamHI和SalI切开的pSP911中。得到的质粒被命名为pSP911-ORF2cc或pSP911-Ess_ORF2cc图2，并分别用于制造每种重组猪痘病毒——SVR15或SVR14。3构建pSP53-ORF2图3SPV的锚蛋白重复序列蛋白ARP从质粒pNZSP52LJP2003-111591A获得。将SEQIDNO：12中示出的合成衔接子替换到pNZSP52L的HindIII与EcoRI之间的区域中，并将得到的质粒命名为pSP53。使用的PCV2-ORF2基因示出在SEQIDNO：13中。该基因被合成，用BamHI和SalI消化，并插入到pSP53的BamHI和SalI位点中。得到的质粒被命名为pSP53-ORF2图3，并用于制造两种重组猪痘病毒，即SVR16和SVR17。SEQIDNO：12：AAGCTTGGCCGGGGGGGCCAGCTCGGTACATAAAAATGTCGACGGATCCGAGTGCAATAAATTAGAATAGTTTTTCAATTTTTACGCGTAATTAATTATTGTATTTATTATTTATATGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTTCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCACCCGGGGATCGATCCAAAAAAATCTTTCGGCCTGCATGAATGGCCTTGTTGATCGCTTATTATTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGGAATTCSEQIDNO：13：GGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGCGTACCACGGTCACAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTTAAACTTGACGACTTTGTTCCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTATACCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCCATCACCCAGGGTGATAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTACCAAAGGCACCAGCCCTAACCTATGACCCATATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACAATCCCCCAACCCTTCTCCTACCACTCCCGTTACTTCACACCCAAACCTGTTCTTGACTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAATAACAAAAGGAATCAGCTTTGGCTGAGGCTACAAACCTCTAGAAATGTGGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTAAATACGACCAAGACTACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCCTAAGTCGAC4pSP72-ORF2的构建图4SPV基因组中胸苷激酶TK基因的侧翼区通过聚合酶链反应PCR来克隆。SEQIDNO：14和15中示出的两条引物合成的寡核苷酸，即SP54242F和SP57617R购自TakaraBio。PCR反应以SPVDNA作为模板，使用LATaq聚合酶TakaraBio和引物组SP54242F和SP57617R，按照生产商的流程来进行。SEQIDNO：14：AATATTACGGGTGCTGTTTSEQIDNO：15：AAAAACATCGTATTCCTG将约3.4kbp的扩增的DNA通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确认，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒Qiagen从所述凝胶纯化。按照生产商的流程将纯化的DNA片段克隆到pCR4-TOPO载体Invitrogen中。挑取14个白色的氨苄青霉素抗性转化子并在LB培养基中生长，使用QuickLyse小量制备试剂盒Qiagen制备每个质粒。将每个质粒用SpeI消化，并选择两种候选质粒插入的DNA的两种方向。使用染料终止物循环测序试剂DTCS和CEQ2000XL测序仪BeckmanCoulter对它们的插入DNA进行测序。候选质粒之一，即pCR-SPV5424257617#2被确认为它含有SPV基因组DNAGeneBankAcc:NC_003389的54,242nt至57,617nt的DNA片段，并被用作基础质粒图4。接下来，使用pCR-SPV5424257617#2作为模板，并使用两种引物组1SEQIDNO：16和17或2SEQIDNO：18和19进行PCR突变，以缺失一部分TK基因nt59-536并引入多个限制性酶位点。SEQIDNO：16：CGTTCATGTTAAGCTTAACCTGAAATATTGSEQIDNO：17：GTTTAAACGAATTCGGTACCCTTAAAAACATCGSEQIDNO：18：CGCCGAGCTCGAGAATATTACGGGTGCTGTTTTTACSEQIDNO：19：CCAGACTGCAGAGAACATAGGTCCTAATATAAG将每种PCR产物施加到0.8％琼脂糖凝胶电泳，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。将纯化的、使用引物组SEQIDNO：16和17通过PCR扩增的DNA片段用两种限制性酶KpnI和HindIII消化，并与用同样的限制性酶切开的pBluescriptKS+Stratagene连接。将得到的质粒pBS-TKRKpn..Hin图4用SacI和PstI消化，并将用同样的限制性酶切开的、使用引物组SEQIDNO：185和19通过PCR扩增的DNA片段插入到其中。得到的质粒被命名为pSP70图4。将SEQIDNO：12中示出的合成衔接子替换到pSP70的HindIII与EcoRI之间的区域中，得到的质粒被命名为pSP711。将用HindIII和SmaI切开pNZ76然后用DNA聚合酶平端化得到的源自于pNZ76的“P7.5启动子–LacZ”基因盒的DNA片段描述在USP5,387,519中连接到pSP711的SmaI位点中。得到的质粒被命名为pSP721图4，并将“P7.5-LacZ”基因盒插入到TK基因中。将SEQIDNO：13中示出的合成的PCV2-ORF2基因也用BamHI和SalI消化，并插入到pSP721的BamHI和SalI位点中，得到的质粒被命名为pSP72-ORF2图4。这个质粒被用作同源质粒来制造重组SPV即SVR20。实施例2生产重组猪痘病毒rSPV1生产rSPV，即SVR14和SVR15图5通过野生型SPV基因组与同源质粒载体之间的同源重组，在ESK-4细胞中产生重组SPV。将6孔板中亚合生的ESK-4细胞用野生型SPVwtSPV感染，并在17hr后使用LipofectaminPlus试剂Invitrogen，将所述wtSPV感染的细胞用2μgpSP911-Ess_ORF2cc或pSP911-ORF2cc转染，并允许其在37℃下温浴5天，直至发生细胞病变效应CPE。来自于感染过的转染细胞的细胞裂解液分别是用于SVR14的转染种子TFS和用于SVR15的TFS。将它们用不含FBS的Ham’sF-12K培养基以1:20稀释，并在96孔板中感染到ESK-4细胞中。7天后，将96孔板中的每个上清液转移到新的空白96孔板，并将感染的细胞用裂解缓冲液20mMTris-Cl，0.1MNaCl，5mMEDTA，0.1％SDS，200μgml蛋白酶K裂解，然后进行热处理60℃5min和98℃2min。使用SYBR-Green试剂Bio-Rad目录号170-8882并使用引物组SEQIDNO：20和SEQIDNO：21，通过qPCR筛选这些感染过的细胞裂解的DNA样品。SEQIDNO：20AAGTGGAGTTTTGGCCATGTSEQIDNO：21TCCAGCACTGGCTTAGGAGT通过qPCR显示出DNA扩增信号的样品是阳性的，并将相应的上清液送往下一个筛选步骤。重复进行筛选，直至所有出现的噬斑被使用抗PCV2猪血清PAB-PCV2，VMR作为第一抗体并使用FITC偶联的抗猪IgG抗体F1638-2ML，SIGMA作为第二抗体的免疫荧光测定法IFA染色。通过三轮筛选，从用于SVR14和SVR15的TFS纯化到两种无wtSPV的重组病毒G2C2C4和D10E5F5克隆，并被分别命名为SVR14和SVR15。2生产rSPV，即SVR16和SVR17图5重组SPV即SVR16通过重组SPV即SVR15基因组与同源质粒载体pSP53-ORF2之间的同源重组来产生。SVR17通过SVR14基因组与同源载体pSP53-ORF2之间的同源重组来产生。将6孔板中的亚合生ESK-4细胞用SVR15或SVR14感染，并在17hr后使用lipofectaminePlus试剂，将所述rSPV感染的细胞用2μgpSP53-ORF2转染。在CPE出现后，通过在营养琼脂覆盖层中添加0.5mgmlBluo-galInvitrogen目录号15519-028对来自于感染且转染的细胞的细胞裂解液用于SVR16和SVR17的TFS就表达β-半乳糖苷酶的重组噬斑进行筛选。通过3-4轮筛选直至所有噬斑均为β-半乳糖苷酶阳性，获得纯化的重组病毒，其被分别命名为SVR16和SVR17。3生产rSPV，即SVR20图5重组SPV即SVR20通过重组SPV即SVR14基因组与同源质粒载体pSP72-ORF2之间的同源重组来产生。将6孔板中的亚合生ESK-4细胞用SVR14感染，并在17hr后使用lipofectaminePlus试剂，将所述SVR14感染的细胞用2μgpSP72-ORF2转染。在CPE出现后，通过在营养琼脂覆盖层中添加0.5mgmlBluo-galInvitrogen目录号15519-028对来自于感染且转染的细胞的细胞裂解液用于SVR20的TFS就表达β-半乳糖苷酶的重组噬斑进行筛选。通过3-4轮筛选直至所有噬斑均为β-半乳糖苷酶阳性，获得纯化的重组病毒，其被命名为SVR20。实施例3重组SPV的体外分析1通过PCR确认SVR14和SVR15的基因组结构和传代后的稳定性为了确认纯化的SVR14和SVR15的基因组结构，按照实施例11中描述的程序制备它们的基因组DNA并作为无传代+0p模板用于PCR。为了确认SVR14和SVR15的基因组稳定性，将它们传递到ESK-4细胞15次+15p，并与+0p一样制备。这些基因组DNA通过PCR进行检查，使用SEQIDNO：22和23中示出的引物组SP7450F和SP8552R图6.SEQIDNO：22CAATTGAAACATCTATATATCCTTSEQIDNO：23CAATGTGAAGCGATAAAATACAGPCR的结果图6显示，纯化的SVR14和SVR15具有预期的基因组结构并且不含野生型SPV，并且它们在体外传代15次后稳定。2确认由SVR14和SVR15表达的PCV2-ORF2蛋白使用抗PCV2大鼠血清，通过15％SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来分析由SVR14和SVR15表达的PCV2-ORF2蛋白的分子大小。将ESK-4细胞用SVR14、SVR15或野生型SPV感染。6天后，将细胞裂解液在15％SDS-PAGE上分级。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯PVDF膜Immobilon-PMerkMillipore，目录号IPVH08130上，并用含0.5％干燥牛奶的PBS阻断。将PDVF膜的印迹用大鼠抗PCV2血清1:1,000作为第一抗体，然后与生物素偶联的山羊抗大鼠IgG第二抗体1:1,000反应，使用VECTASTAINABC-AP标准试剂盒VectorLabs,AK-5000来探测。膜印迹用碱性磷酸酶底物硝基四氮唑蓝NBT5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯BCIP显色。蛋白质印迹分析的结果显示，SVR14表达两种ORF2，分子大小为27kDa和25kDa图7。前一种27kDa蛋白据推测是前体形式，后者据推测是在信号肽末端切割后的加工形式。另一方面，SVR15只表达27kDa蛋白，其位于被感染的细胞核中图7。3确认双重组体SVR16和SVR17的基因组结构为了确认纯化的SVR16和SVR17的基因组结构，按照实施例11中描述的程序制备它们的基因组DNA，并作为无传代+0p模板用于PCR。为了确认SVR16和SVR17的基因组稳定性，将它们传递到ESK-4细胞15次+15p，并与+0p一样进行制备。这些基因组DNA通过PCR来检查，使用在SEQIDNO：24和25中示出的引物组P05-8和P05-9图8。SEQIDNO：24TATGTCTAAAGGTGCGTCTASEQIDNO：25AGTGGCTATATTATCATCCTGPCR的结果图8显示，纯化的SVR16和SVR17具有预期的基因组结构，并且它们在体外传代15次后稳定。4确认双重组体SVR20的基因组结构为了确认纯化的SVR20的基因组结构，按照实施例11中描述的程序制备它的基因组DNA，并作为无传代+0p模板用于PCR。为了确认SVR20的基因组稳定性，将它传递到ESK-4细胞15次+15p，并与+0p一样进行制备。这些基因组DNA通过PCR来检查，使用引物组aSEQIDNO：22和23中示出的SP7450F和SP8552R，用于IL18bp位点，和bSEQIDNO：26和27中示出的SP55500F和SP56363R，用于TK位点图9。SEQIDNO：26ATACGATTAAGCGATAGTGATASEQIDNO：27ATATTATTTTCATTTGTTTCCTAPCR的结果图9显示，纯化的SVR20具有预期的基因组结构，并且它在体外传代15次后稳定。5确认由SVR16、SVR17和SVR20表达的PCV2-ORF2蛋白通过蛋白质印迹来分析由重组SPV表达的PCV2-ORF2蛋白。将6孔板中的ESK-4细胞用野生型SPV、SVR14、SVR15、SVR16、SVR17或SVR20以0.1的感染复数M.O.I.感染。6天后，将细胞裂解液施加到15％SDS-PAGE并转印到PVDF膜上。在用含0.5％干燥牛奶的PBS阻断后，将PDVF膜的印迹用大鼠抗PCV2血清1:500作为第一抗体，然后与生物素偶联的山羊抗大鼠IgG第二抗体1:1,000反应，使用VECTASTAINABC-AP标准试剂盒VectorLabs,AK-5000来探测。膜印迹用碱性磷酸酶底物硝基四氮唑蓝NBT5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯BCIP显色。蛋白质印迹分析的结果图10令人吃惊地显示，本发明的双重缺陷病毒比单缺陷病毒更高效地表达外源基因：SVR16表达比SVR15更多的25kDa蛋白，SVR17和SVR20表达比SVR14更多的两种ORF227kDa的前体和25kDa的加工过的蛋白。实施例4用于rSPV的安全性试验的猪试验1猪的免疫接种12只SPF猪ZEN-NOH优等猪购自NationalFederationofAgriculturalCo-operativeAssociationsChiba,Japan并被分成4组N＝每组3只。组1至4的每只猪在4周龄时，在颈部右侧使用23G1.5英寸针头，分别用1ml104TCID50ml的SVR16、SVR17、SVR20或野生型SPVwtSPV免疫接种。2免疫过的猪的观察从疫苗接种后1天1-DPV至18-DPV观察疫苗接种位点。在试验期间，所有猪都是健康的，并且除了在用SVR16、SVR17或wtSPV疫苗接种的注射位点处的皮肤反应之外，不显示出临床病情例如腹泻或呼吸道症状。皮肤炎性反应产生的红斑的尺寸被定量确定为体积[宽度mmx深度mm＝mm2]。宽度W是作为红斑的较长轴方向的X-轴。深度D是作为红斑的较短轴方向的Y-轴。免疫过的猪的红斑尺寸概述在表1中并作图于图11中。表1.组1至4的猪中的红斑尺寸mm2在用野生型SPV疫苗接种的猪中红斑面积最大。在用SVR20免疫的猪的注射位点处没有观察到红斑。这些结果显示，IL18-bp和TK基因双缺失重组体比野生型SPV安全得多。SVR20显得毒性特别减弱。实施例5rSPV的免疫原性和安全性试验的第二次猪试验1免疫接种30只SPF猪ZEN-NOH优等猪购自NationalFederationofAgriculturalCo-operativeAssociationsChiba,Japan并被分成6组N＝每组5只。组3的猪在4周龄时，在颈部右侧中用1ml105TCID50ml的SVR20肌肉内免疫接种。组4的猪在颈部右侧中用1ml用于PCV2的商品化疫苗IngelvacCircoFLEXBoehringerIngelheimVetmedica肌肉内免疫接种。组5和6的猪未免疫接种。所有用SVR20疫苗接种的猪看起来都健康。2对猪的PCV2激惹在疫苗接种后3周，将组1至5的猪通过在右鼻孔中喷洒6x105TCID50的PCV2bRm40毒株从Ceva-Phylaxia,Hungary进口进行激惹。组6的猪是未免疫并且未激惹的对照。3淋巴器官中的PCV2载量在激惹后3周10周龄，将所有猪安乐死并解剖。使用清洁、分开的剪刀和镊子取出4种淋巴结，即腹股沟淋巴结ILN、肺门淋巴结HLN、扁桃体和肠系膜淋巴结MLN的切片。将它们的切片置于无菌50mlEppendorf管中并保持在-80℃下，直至进一步加工。通过QIAampDNA小量试剂盒QIAGEN，按照制造商的说明书从器官样品提取DNA。PCV2DNA使用基于TaqMan的实时PCR进行定量，所述方法描述在J.Virol.Methods,2004Dec15；1222:171-178PMID:15542141中。PCV2阳性1x103个拷贝mg器官猪的比率概述在表2中。表2.在激惹后3周后4种淋巴器官中PCV2阳性的猪使用本发明的双重缺陷病毒的疫苗接种非常有效地抑制淋巴结中的PCV2载量。具体来说，对于HLN中的PCV2载量来说，所有G5的猪未疫苗接种是PCV2阳性的100％，而G3SVR20疫苗接种的中仅仅一只猪是阳性的20％。引人注目的是，用商业化抗PCV2疫苗接种的G4的猪中的病毒载量高得多80％阳性的猪。对于ILN中的PCV2载量来说，所有G5的猪未疫苗接种是PCV2阳性的100％，而所有G3SVR20疫苗接种的猪是阴性的0％。引人注目的是，用商业化抗PCV2疫苗接种的G4的猪中的病毒载量更高20％阳性的猪。对于扁桃体中的PCV2载量来说，所有G5的猪未疫苗接种是PCV2阳性的100％，而G3SVR20疫苗接种的中仅仅一只猪是阳性的20％。同样地，用商业化抗PCV2疫苗接种的G4的猪中的病毒载量高得多60％阳性的猪。对于MLN中的PCV2载量来说，G5未疫苗接种的大多数猪是PCV2阳性的80％，而所有G3SVR20疫苗接种的猪是阴性的0％。用商业化抗PCV2疫苗接种的G4的猪中的病毒载量更高20％阳性的猪。这些结果显示，用SVR20进行疫苗接种比用商品化疫苗进行接种提供强得多的保护。序列表法国诗华大药厂多价重组SPVB226327PatentInversion3.3122DNAArtificialoligonucleotide1cgaattcattcctttatcttta22221DNAArtificialoligonucleotide2ggaactacgttatacgatcat21338DNAArtificialoligonucleotide3ttcgcccttacggtaccattcctttatctttataaacg38439DNAArtificialoligonucleotide4ctataatattaaataagctttatggagttgtttaaatac39535DNAArtificialoligonucleotide5cacacgataacactgcagtccacatattacggttc35632DNAArtificialoligonucleotide6gccgcgaattcgccctcgaggagctcactacg32746DNAArtificialoligonucleotide7aattgcccgggtaccgtcgatcgactttttatggcccccccggcca46846DNAArtificialoligonucleotide8agcttggccgggggggccataaaaagtcgatcgacggtacccgggc469103DNAArtificialoligonucleotide9ggtaccgagctcggtagcccgggccatggtagatcctctagaggatccaattcatttata60gcatagaaaaaaacaaaatgaaattctactatattttctgcag10310702DNAArtificialsyntheticORF210atgacctaccctagaagaagatataggaggcggaggcatcggccacggagtcacctggga60caaattctgcggagaaggccatggttggtgcatccaagacatagatataggtggaggaga120aagaacggaatctttaatacaagactgtctagaacttttgggtacaccgtgaaaagaaca180accgtgaggaccccatcttgggccgttgatatgatgaggtttaacatcaacgatttcttc240cctcctgggggaggatctaatcctagatccgttccattcgagtattataggatcaggaaa300gtgaaagtggagttttggccatgtagcccaattactcaaggagatagaggtgttggatct360agcgccgtgatcctggacgacaatttcgtgaccaaagcaaccgcactgacttacgatcct420tacgtgaattattctagcagacacactattactcaaccatttagctatcacagcagatat480ttcactcctaagccagtgctggacagcaccatcgactattttcagcctaataataagagg540aatcaactttggcttaggcttcagaccgccgggaacgtggatcacgtgggattgggaacc600gcatttgagaattctatttatgatcaagagtataacattagagtgactatgtacgtgcag660tttagggagttcaacctgaaagatccacctctgaatccataa70211702DNAArtificialsyntheticORF211atgaaaacgatttccgttgttacgttgttatgcgtactacctgctgttgtttattcaaca60tgtactgtacccactatgaataacgctaaattgacgtctaccgaaacatcgtggaaaaaa120gagaaaggagtcttgaacaccagattgtctagaaccttcggttacaccattaagagaacc180accgtcaaaaccccatcttgggctgtcgatatgatgagattcaacatcaacgatttcgtc240ccacctggtggtggatcaaaccctagatccgttccattcgagtactacagaatcagaaaa300gtcaaagtcgagttctggccatgctctcctattactcagggtgatagaggagttggatca360actgccgtcatcttggatgacaacttcgtcactaaggctactgccttgacctacgatcct420tacgtcaattactctagtagacacaccatcacccaaccattctcataccattccagatac480ttcactccaaaacctgtcttggactcaaccatcgattactttcaaccaaacaacaagaga540aaccaattgtggttgagattgcaaactgccggtaacgtcgatcatgtcggattgggaacc600gccttcgaaaactccaaatacgaccaggagtacaacattagagtcaccatgtacgtccaa660ttcagagagttcaacttgaaggacccaccattgaacccataa70212288DNAArtificialoligonucleotide12aagcttggccgggggggccagctcggtacataaaaatgtcgacggatccgagtgcaataa60attagaatagtttttcaatttttacgcgtaattaattattgtatttattatttatatgcc120aaaaaaaaaaaaaaaaaaaagcttcataaaaagtcgatcgacggtaccacccggggatcg180atccaaaaaaatctttcggcctgcatgaatggccttgttgatcgcttattattatttttg240acaccagaccaactggtaatggtagcgaccggcgctcagctggaattc28813714DNAArtificialsyntheticORF213ggatccatgacgtatccaaggaggcgttaccgcagaagaagacaccgcccccgcagccat60cttggccagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccccgccaccgctaccgttgg120agaaggaaaaatggcatcttcaacacccgcctctcccgcaccttcggatatactgtcaag180cgtaccacggtcacaacgccctcctgggcggtggacatgatgagatttaaacttgacgac240tttgttcccccgggaggggggaccaacaaaatctctataccctttgaatactacagaata300agaaaggttaaggttgaattctggccctgctcccccatcacccagggtgataggggagtg360ggctccactgctgttattctagatgataactttgtaccaaaggcaccagccctaacctat420gacccatatgtaaactactcctcccgccatacaatcccccaacccttctcctaccactcc480cgttacttcacacccaaacctgttcttgactccactattgattacttccaaccaaataac540aaaaggaatcagctttggctgaggctacaaacctctagaaatgtggaccacgtaggcctc600ggcactgcgttcgaaaacagtaaatacgaccaagactacaatatccgtgtaaccatgtat660gtacaattcagagaatttaatcttaaagaccccccacttaacccctaagtcgac7141419DNAArtificialoligonucleotide14aatattacgggtgctgttt191518DNAArtificialoligonucleotide15aaaaacatcgtattcctg181630DNAArtificialoligonucleotide16cgttcatgttaagcttaacctgaaatattg301733DNAArtificialoligonucleotide17gtttaaacgaattcggtacccttaaaaacatcg331836DNAArtificialoligonucleotide18cgccgagctcgagaatattacgggtgctgtttttac361933DNAArtificialoligonucleotide19ccagactgcagagaacataggtcctaatataag332020DNAArtificialoligonucleotide20aagtggagttttggccatgt202120DNAArtificialoligonucleotide21tccagcactggcttaggagt202224DNAArtificialoligonucleotide22caattgaaacatctatatatcctt242323DNAArtificialoligonucleotide23caatgtgaagcgataaaatacag232420DNAArtificialoligonucleotide24tatgtctaaaggtgcgtcta202521DNAArtificialoligonucleotide25agtggctatattatcatcctg212622DNAArtificialoligonucleotide26atacgattaagcgatagtgata222723DNAArtificialoligonucleotide27atattattttcatttgtttccta23

权利要求：1.一种重组猪痘病毒rSPV，其至少具有第一和第二缺陷型病毒基因，其中所述第一缺陷型病毒基因是IL18bp基因，并且所述第二缺陷型病毒基因是胸苷激酶TK或锚蛋白重复序列蛋白ARP基因。2.权利要求1的rSPV，其中所述rSPV包含所述TK基因序列中的至少50bp的缺失和所述IL18bp基因序列中的至少50bp的缺失。3.权利要求1的rSPV，其包含所述TK基因序列中的至少100bp的缺失和所述IL18bp基因序列中的至少100bp的缺失，优选为所述TK基因序列中的至少200bp的缺失和所述IL18bp基因序列中的至少200bp的缺失，甚至更优选为所述TK基因序列中的至少300bp的缺失和所述IL18bp基因序列中的至少300bp的缺失。4.权利要求1的rSPV，其中所述rSPV包含所述ARP基因序列中的至少50bp的缺失和所述IL18bp基因序列中的至少50bp的缺失。5.权利要求1至4任一项的rSPV，其还包含被放置成代替所述缺陷型病毒TK、ARP或IL18bp基因序列的第一外源基因序列。6.权利要求1至5任一项的rSPV，其中所述rSPV基因组包含在TK基因序列中的至少100bp的缺失，并且其中所述第一外源基因序列位于所述缺失中。7.权利要求1至6任一项的rSPV，其中所述rSPV包含被放置成代替缺失的病毒TK基因序列的第一外源基因序列和被放置成代替缺失的病毒IL18bp基因序列的第二外源基因序列。8.权利要求1至5任一项的rSPV，其中所述rSPV包含被放置成代替缺失的病毒ARP基因序列的第一外源基因序列和被放置成代替缺失的病毒IL18bp基因序列的第二外源基因序列。9.前述权利要求任一项的rSPV，其中所述第一和或第二外源基因序列编码抗原，优选为PCV2抗原。10.前述权利要求任一项的rSPV，其中所述第一和或第二外源基因序列编码PCV2衣壳抗原，优选为PCV2ORF2蛋白或肽。11.前述权利要求任一项的rSPV，其中所述第一和或第二外源基因序列各自含有转录启动子。12.权利要求11的rSPV，其中每个启动子选自痘苗病毒7.5-kD启动子P7.5k、11-kD启动子P11k或28-kD启动子P28k，人工合成的痘病毒启动子Ps，鸡β-肌动蛋白Bac启动子或其衍生物，Pec启动子，鼠巨细胞病毒Mcmv立即早期ie1启动子，人巨细胞病毒启动子Hcmv，猴病毒SV40启动子和劳斯肉瘤病毒RSV启动子或其保留启动子活性的任何片段。13.前述权利要求任一项的rSPV，其包含被插入以代替所述rSPV基因组的缺失的TK基因序列的、编码PCV2抗原的第一核酸序列，和被插入以代替所述rSPV基因组的缺失的IL18bp基因序列的、编码PCV2抗原的第二核酸序列。14.一种重组猪痘病毒rSPV，其具有缺陷型病毒IL18bp基因。15.一种核酸分子，其包含前述权利要求任一项的rSPV的基因组。16.一种宿主细胞，其包含权利要求1至14任一项的rSPV或权利要求15的核酸分子。17.一种用于生产权利要求1至13任一项的rSVP的方法，所述方法包括用权利要求14的核酸分子感染感受态细胞并收集所述rSVP。18.一种组合物，其包含权利要求1至10任一项的rSVP和赋形剂。19.权利要求14的组合物，其是疫苗。20.权利要求1至10任一项的rSPV，其用于使猪对病原体免疫。21.一种用于使猪免疫的疫苗接种试剂盒，其包含下述组分：a.有效量的权利要求15的疫苗，和b.用于将所述疫苗给药到所述猪的装置。

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