买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：沈阳航空航天大学

摘要：本发明涉及DNA链置换技术，提出了一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法。将DNA双链[DNA1,DNA2]与DNA单链DNA3混合，DNA3中片段1*和9*与DNA1中的互补片段1和9在碱基互补作用下，促使DNA1形成发卡结构，进而DNA2从DNA1上脱落，形成DNA3对DNA2的链置换。该DNA链置换过程中，置换链DNA3与被置换链DNA2之间在碱基排列上无任何依赖关系，实现了一种不需要立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法。该方法可以用于替代目前依赖立足点的DNA链置换方法，可广泛应用于生物计算，基因编辑以及纳米技术。

主权项：1.一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：步骤1：设计具有发卡结构的DNA序列，作为DNA链置换中结合DNA被置换链的DNA模板链；步骤2：根据步骤1中DNA模板链的发卡结构茎部和环部的碱基排列，设计互补的DNA序列，作为DNA链置换的DNA被置换链；步骤3：根据步骤1中DNA模板链5’-端和3-’端的DNA序列片段，设计DNA链置换中的DNA置换链；步骤1中，DNA链置换中的DNA模板链具有发卡结构；发卡结构茎部的DNA片段长度不小于3个碱基，环部的DNA片段长度不小于2个碱基；步骤2中的DNA被置换链的碱基排列只与DNA模板链的茎部和环部的DNA序列片段存在碱基互补关系；步骤3中的DNA置换链的碱基排列只与DNA模板链的5’-端和3’-端的DNA序列片段存在碱基互补关系；步骤3中的DNA置换链的碱基排列设计与步骤2中的DNA被置换链的碱基排列不存在依赖关系。

全文数据：一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法技术领域本发明涉及DNA计算领域，尤其涉及DNA链置换技术。背景技术作为一种新型的计算模型，DNA计算的研究与应用得到了广泛的关注。近年来，随着DNA链置换技术在DNA计算中的应用，相继实现了基于DNA链置换的DNA逻辑门、DNA电路、DNA纳米计算设备，DNA计算逐渐由理论研究进入了实用化研究阶段。DNA链置换是利用DNA分子杂交过程中的自由能最终趋于稳定的特性，通过在DNA模板链上设计立足点toehold和分支迁移域branchmigrationdomain，触发或控制DNA链置换反应，即用较长的DNA置换链与DNA模板链上的立足点先行杂交，然后在分支迁移作用下，通过对DNA模板链上的分支迁移域上杂交的DNA被置换链进行置换与取代的过程张成,马丽娜,董亚非,etal.自组装DNA链置换分子逻辑计算模型[J].科学通报,2012,5731：2909-2915。直观上看，DNA链置换就是在DNA置换链存在的情况下，通过DNA分子的杂交反应，将DNA模板链上杂交的DNA被置换链进行置换取代的过程，过程的结果是DNA被置换链由双链杂交状态变为游离状态。目前在DNA链置换的方法设计中，要求必须在DNA模板链上预先设计立足点与分支迁移域，且立足点与分支迁移域之间不能存在太多的碱基序列片段间隔GenotAJ,ZhangDY,BathJ,etal.RemoteToehold：AMechanismforFlexibleControlofDNAHybridizationKinetics[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2011,1337：2177-2182。但无论是否在立足点和分支迁移域之间存在碱基序列片段间隔，在DNA链置换中，立足点与分支迁移域均必须设计在DNA模板链上，且由于在DNA置换链、DNA模板链、DNA被置换链之间发生分支迁移过程，使得DNA置换链的碱基排列必须要与DNA模板链上的立足点和分支迁移域构成碱基互补关系，同时DNA被置换链的碱基排列必须与DNA模板链的分支迁移域的碱基排列构成碱基互补关系。上述在DNA模板链、DNA置换链和DNA被置换链之间的立足点与分支迁移域处的碱基排列依赖关系，使得在DNA链置换的应用中，立足点的设计成为关键，而立足点处的DNA片段长度一般仅为3-6个碱基姚莉娜,田桂花,叶盟盟,etal.DNA链置换技术的研究现状与展望[J].郑州轻工业学院学报自然科学版,20141：15-21，这大大增加了DNA链置换中DNA置换链、DNA模板链、DNA被置换链在碱基排列上的依赖耦合度，极大的增加了DNA序列设计难度，限制了DNA链置换的应用。发明内容针对DNA链置换中的立足点与分支迁移域对DNA链置换应用的限制问题，本发明所采用的技术方案为提供一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法。该方法在DNA模板链上设计发卡结构，以DNA模板链的5’-端与3’-端DNA片段作为DNA置换链的杂交结合域，对杂交在DNA模板链上的DNA被置换链进行置换取代。本发明涉及以下的具体技术方案：首先，设计DNA模板链DNA1、DNA被置换链DNA2和DNA置换链DNA3图1，具体包含以下步骤：步骤1：在DNA模板链DNA1上，设计发卡结构：发卡茎部对应为DNA1上DNA片段4和其互补DNA片段4*，发卡环部对应DNA1上DNA片段5和6；步骤2：为保证DNA被置换链DNA2与DNA模板链DNA1的稳定杂交，在DNA模板链DNA1上设计DNA片段7；步骤3：DNA模板链DNA1的5’-端和3’-端设计DNA片段1、2、3和8、9，其中DNA片段2、3、8作为冗余DNA片段，可用于其它功能设计，DNA片段1和9作为DNA置换链DNA3的杂交结合域，其中DNA片段1和9各自的碱基序列不少于5个碱基；步骤4：根据DNA1中的DNA片段64*7的碱基排列，设计DNA被置换链DNA2，其中DNA片段6*47*为DNA片段64*7的碱基互补序列，DNA2两端的DNA片段10和11作为冗余DNA序列，可用于其它功能设计；步骤5：根据DNA1的DNA片段1和9的碱基排列，设计DNA置换链DNA3，其中DNA置换链DNA3的DNA片段1*和9*分别为DNA片段1和9的碱基互补序列，DNA片段x作为冗余DNA序列，可用于其它功能设计，且碱基序列不多于5个碱基；其次，经过上述步骤的DNA片段设计，得到DNA链置换的模板链DNA1、DNA被置换链DNA2和DNA置换链DNA3。将DNA1与DNA2退火杂交，得到DNA双链[DNA1,DNA2]；加入DNA3后，DNA3的DNA片段1*和9*分别与DNA1的DNA片段1和9通过碱基互补实现杂交结合；在DNA3作用下，DNA1发生变构，形成发卡结构，DNA3从DNA1上脱落，完成DNA链置换。该DNA链置换过程中，DNA置换链DNA3与DNA被置换链DNA2之间在碱基上无任何依赖关系，实现了一种没有立足点与分支迁移域的DNA链置换方法。本发明与现有技术方法相比具有以下优点：1、在DNA链置换中，DNA模板链不需要设计立足点和分支迁移域；2、在DNA链置换中，DNA置换链和DNA被置换链在碱基排列上没有依赖关系，实现了DNA置换链和DNA被置换在DNA序列设计上的解耦合；3、在DNA置换链、DNA模板链、DNA置换链之间不发生分支迁移过程。该DNA链置换新方法可以用于替代目前依赖立足点和分支迁移域的DNA链置换方法，可广泛应用于DNA计算，DNA电路以及DNA纳米技术。附图说明下列图示中箭头端对应DNA序列的3’-端,平头端对应DNA序列的5’-端。图1DNA链置换新方法原理示意图；图2DNA链置换新方法原理验证PAGE电泳结果；图3DNA片段10长度变异对比分析PAGE电泳结果；图4DNA片段7长度变异对比分析PAGE电泳结果；图5DNA片段1与1*长度变异对比分析PAGE电泳结果1；图6DNA片段1与1*长度变异对比分析PAGE电泳结果2；图7DNA片段冗余性验证PAGE电泳结果；图8DNA模板链片段碱基序列随机变异PAGE电泳结果；图中泳道编号上部标注泳道内的反应物名称，泳道编号下部为反应物的摩尔浓度比。DNA双链用方括号表示，括号内为组成双链的对应DNA单链，“+”表示反应物的混合。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。实施例中的DNA序列购自上海生工，其中DNA序列经过PAGE纯化，实施例中的DNA分子序列见表1。实施例中应用的试剂为：EDTA2Na、Tris、冰乙酸、醋酸镁、过硫酸铵、聚丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺和StainsaLL。1×TAEMg2+缓冲液：40mmoLLTris，20mmoLL乙酸，1mmoLLEDTA2Na，12.5mmoLL醋酸镁,pH＝8.0。浓度为40％的丙烯酰胺母液：190g丙烯酰胺和10gN,N'-甲叉双丙烯酰胺，37℃水溶后,加去离子水定容至500mL。所有DNA链经Nanodrop2000分光光度计ThermoFisherScientificInc.USA进行浓度测定。荧光信号采用实时荧光PCR仪AgiLent，G8830A检测，最大吸收波长为550nm，最大发射波长为564nm。实施例中的DNA双链[DNA1,DNA2]经退火95℃4分钟，65℃30分钟，50℃30分钟，37℃30分钟，22℃30分钟，20℃保存生成，然后加入DNA置换链DNA3，25℃下经过2小时的常温链置换反应，链置换反应缓冲液为1×TAEMg2+缓冲液。实施例的结果采用PAGE凝胶电泳方式进行检测。表1实施例中用到的DNA序列实施例1DNA链置换新方法原理验证根据图1中DNA链置换的设计方法，图2给出该DNA链置换新方法的PAGE检测结果。图2中的DNA序列DNA1-1、DNA2-1、DNA3-1分别对应图1中设计方法的DNA模板链DNA1、DNA被置换链DNA2、DNA置换链DNA3。首先，由泳道4中的电泳带分布，可以看到DNA模板链与DNA被置换链能够稳定形成DNA双链[DNA1-1,DNA2-1]。同时，泳道9中电泳带为DNA双链[DNA1-1,DNA3-1]，作为确认链置换结果的参照对比电泳带。泳道5-8分别为不同摩尔浓度比下DNA链置换的结果。由泳道5-8的电泳带，可以看到，对于DNA模板链与DNA被置换链[DNA1-1,DNA2-1]，在添加DNA置换链DNA3-1后，均能够将DNA被置换链DNA2-1置换出来，形成明显的电泳带[DNA1-1,DNA3-1]。其中在泳道5-7中，可以明显看到置换出来的DNA被置换链[DNA2-1]的电泳带。该实例说明了本发明提供的DNA链置换新方法的有效性及可实施性。实施例2DNA被置换链DNA片段长度变异对比分析图3为图1中DNA被置换链DNA2上冗余DNA片段10的长度变异对DNA链置换影响的对比分析。本实施例中，DNA被置换链DNA2-2-016、DNA2-2-116、DNA2-2-316在DNA片段10的长度分别为0、1、2。由泳道7与泳道9的对比可知，在添加DNA置换连DNA2-2-016时，双链[DNA1-2,DNA2-2-016]没有形成，因此，泳道8中对应DNA被置换链DNA2-2-016的电泳带不是由于DNA3-2的链置换而形成的，是源自没有与DNA模板链DNA1-2杂交的游离的DNA2-2-016因此在case3-1中未发生DNA链置换。由泳道5的电泳带可知，DNA双链[DNA1-2,DNA2-2-116]能够稳定形成，对应于泳道6中的电泳带分布可知，在添加DNA置换链[DNA3-2]后，双链[DNA1-2,DNA2-2-116]中的DNA被置换链DNA2-2-116被置换出，形成泳道6中的最下部的电泳带，因此在case2-1中发生了DNA链置换。由泳道3与泳道4的电泳带分布可知，在DNA置换链[DNA3-2]存在的情况下，DNA双链[DNA1-2,DNA2-2-316]中的DNA被置换链DNA2-2-316被置换出，形成泳道4中的上部电泳带[DNA1-2,DNA3-2]，因此在case1-1中发生了DNA链置换。图4为图1中DNA被置换链DNA2上冗余DNA片段7的长度变异对DNA链置换影响的对比分析。本实施例中，DNA被置换链DNA2-2-018、DNA2-2-118、DNA2-2-318在DNA片段10的长度分别为0、1、3，在DNA片段7的长度均为8，与此相对，图2中的DNA被置换链DNA2-2-016、DNA2-2-116、DNA2-2-316在DNA片段7处的长度为6。由泳道5与泳道6case2-2以及泳道7与泳道8case3-2可知实现了DNA置换链DNA3-2对DNA被置换链DNA2-2-118及DNA2-2-018的置换，尤其是在泳道8中，可以明显看到被置换出来的DNA被置换链DNA2-2-018的电泳带。但是由泳道4case1-2中最上部电泳带与泳道9中最上部电泳带的对比可知，case1-2中未实现DNA链置换。由图3与图4的PAGE电泳结果可知，在case1-1、case2-1、case2-2、case3-2中均实现了DNA链置换，说明DNA被置换链DNA2的DNA片段10与DNA片段7存在冗余性，可以用于其它功能设计，验证了该方法的通用性。实施例3DNA模板链与DNA置换链序列长度变异对比分析在实施例2的基础上，对DNA模板链与DNA置换链进行长度变异对比分析。分别对应于图3和图4，图5和图6对DNA模板链DNA1在DNA片段1处的碱基序列进行了延长，相应的对DNA置换链DNA3在DNA片段1*处的碱基序列进行了延长。与实施例2中的DNA模板链DNA1-2相比，本实施例中DNA模板链DNA1-3在DNA1-2的5’-端延长了4个碱基的长度，DNA置换链DNA3-3在DNA3-2的3’-端延长了4个碱基的长度。类似于实施例2中的泳道分析，由图5case3-1泳道8的电泳带可知，DNA模板链DNA1-3没有与DNA2-2-016形成稳定的DNA双链，故在泳道9中未发生DNA链置换。而图5中case1-1和图5中case2-1两种情况下均实现了DNA链置换。图6中的三种情况下均实现了DNA链置换。实施例4DNA片段冗余性验证图7中泳道3和泳道4对DNA模板链与DNA被置换链的双链电泳带，通过与泳道1中DNA模板链电泳带的对比，可知DNA双链[DNA1-4,DNA2-4-36]与[DNA1-4,DNA2-4-37]均能够稳定形成。图7中泳道4和泳道5为DNA模板链与DNA置换链杂交后的电泳带，用于DNA链置换结果的参照对比。泳道7-10为加入DNA置换链后的反应结果。由泳道7-10中上部电泳带与泳道5和泳道6中电泳带的对比，可知，在四种情况下均实现了DNA链置换，同时在泳道7-10的下部可以明显看到被置换出的DNA被置换链的电泳带。实施例5DNA模板链序列变异结果对比分析在实施例4基础上，对DNA模板链进行序列变异对比分析。实施例5中DNA模板链DNA1-5在除与DNA置换链DNA3-4-T93和DNA3-4-T102的杂交结合域外的DNA片段处进行随机变异。由泳道1的电泳带分布可知，DNA模板链与DNA被置换链能够形成稳定的DNA双链。泳道2和泳道3为DNA模板链与DNA置换链杂交后的电泳带，用于DNA链置换结果的参照对比。泳道4-7为加入DNA置换链后的反应结果。由泳道4-7中上部电泳带与泳道2和泳道3中电泳带的对比，可知，在四种情况下均实现了DNA链置换，同时在泳道4-7的下部可以明显看到被置换出的DNA被置换链的电泳带。

权利要求：1.一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：步骤1：设计具有发卡结构的DNA序列，作为DNA链置换中结合DNA被置换链的DNA模板链；步骤2：根据步骤1中DNA模板链的发卡结构茎部和环部的碱基排列，设计互补的DNA序列，作为DNA链置换的DNA被置换链；步骤3：根据步骤1中DNA模板链5’-端和3-’端的DNA序列片段，设计DNA链置换中的DNA置换链。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，DNA链置换中的DNA模板链具有发卡结构；发卡结构茎部的DNA片段长度不小于3个碱基，环部的DNA片段长度不小于2个碱基。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中的DNA被置换链的碱基排列只与DNA模板链的茎部和环部的DNA序列片段存在碱基互补关系。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中的DNA置换链的碱基排列只与DNA模板链的5’-端和3’-端的DNA序列片段存在碱基互补关系。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中的DNA置换链的碱基排列设计与步骤2中的DNA被置换链的碱基排列不存在依赖关系。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：DNA链置换中不需要设计立足点和分支迁移域。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在DNA置换链将DNA被置换链从DNA模板链上置换出来的过程中，DNA置换链、DNA模板链、DNA被置换链之间不发生分支迁移过程。

百度查询： 沈阳航空航天大学 一种无立足点和分支迁移域的DNA链置换新方法