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申请/专利权人：苏州市种子管理站;江苏省中国科学院植物研究所

摘要：本发明公开了一种鉴定玉祁红芹的ISSR‑SCAR标记及其鉴定方法，通过对玉祁红芹和其它水芹品种进行总DNA提取、PCR扩增、引物筛选和ISSR‑SCAR检测，筛选到鉴定玉祁红芹的ISSR‑SCAR分子标记，并建立分子鉴别方法。SEQIDNO:1所示引物可以在玉祁红芹样品中扩增得到SEQIDNO:2所示片段，根据此片段设计SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物，成功进行玉祁红芹的品种鉴别。本发明操作简便、稳定可靠，首次应用于玉祁红芹品种的分子鉴定，可用于该品种的选种、育种、种植、采收和品种贸易等各环节的快速鉴定，同时对保护地理标志产品的种质资源具有重要的意义。

主权项：1.能够在玉祁红芹中扩增得到的特异性DNA片段，其特征在于,该片段的核苷酸序列如SEQIDNO:2所述；特异性DNA片段使用核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的ISSR引物在玉祁红芹中扩增出的一条特异性条带。

全文数据：一种鉴定玉祁红芹的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法技术领域本发明属于分子标记鉴定领域，特别涉及一种鉴定玉祁红芹的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法。背景技术水芹[OenanthejavanicaBlumeDC.]为伞形科水芹属多年生草本水生植物，原产亚洲东部，是中国特有的芳香蔬菜之一。水芹不仅含有丰富的维生素、矿质元素和膳食纤维，而且具有降血压、降血糖和抗癌的潜在功效。玉祁红芹原产江苏无锡和常州一带，生长势和耐寒性强。目前对玉祁红芹的鉴别主要依据其形态学特征，如二回羽状复叶，互生，叶柄细长，基部粗壮，叶缘和心叶紫色，低温时全株叶片变紫色等。但由于大部分水芹品种苗期相似，直到成株才开始表现出品种形态特性，因此品种鉴定往往需要一定时间。为了更加有效地区分外形相似的不同水芹品种，保护其种质资源，开发稳定、准确的鉴别技术体系迫在眉睫。近年来，DNA分子标记技术逐步成熟和完善，在遗传图谱构建、品种鉴定、亲缘关系分析和基因定位等方面得到了广泛的应用。目前常用的DNA分子标记主要有基于DNA分子杂交的RFLP、小卫星DNA等和基于PCR反应的RAPD、SCAR、SSR、ISSR、SRAP等。其中，序列特异性扩增区域（Sequencecharacterizedamplifiedregions,SCARs）标记通常是由RAPD、SRAP、ISSR标记转化而来，是将上述分子标记筛选出的特异标记片段进行克隆和测序，并根据其碱基序列设计特异引物，用于对特征扩增区域的特异性扩增。SCAR标记一般表现为扩增片段的有或无，是一种显性标记，具有稳定性好、可重复性强等优点，目前已成为育种实践中能直接应用的首选标记。目前对不同水芹品种间的鉴别研究极少，仅见赵书花运用RAPD分子标记技术初步研究了20个水芹栽培品种的遗传多样性和亲缘关系，由于该研究中每个水芹品种仅选用了一个个体，且此分子标记技术本身存在实验重复性较差和结果可靠性较低等缺点，因此研究结论的可靠性存疑。本发明是首次对玉祁红芹进行分子标记研究，本发明提供的鉴定玉祁红芹的ISSR-SCAR标记方法具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，能够实现对玉祁红芹品种的特异性鉴定，对于地理标志产品的保护与种质资源的保存具有重要的意义。发明内容本发明的目的是提供一种鉴定玉祁红芹的ISSR-SCAR标记方法，通过提供鉴别玉祁红芹的一个DNA片段、一组特异性鉴别引物和一套鉴别体系，实现对玉祁红芹品种的特异性鉴定，为保护地理标志产品的种质资源提供有力的技术支持。本发明采用的技术方案如下：能够在玉祁红芹中扩增出特异性条带的ISSR引物，该引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述。本发明所述核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的引物是通过96条ISSR引物对玉祁红芹和其它4种江淮地区主栽的水芹品种（包括常熟白芹、苏州圆叶芹、江阴青芹、梅南水芹）进行PCR扩增，筛选出的能够在玉祁红芹中扩增出特异性条带的引物。进一步的，能够在玉祁红芹中扩增得到的特异性DNA片段，该片段的核苷酸序列如SEQIDNO:2所述。SEQIDNO:2所示的基因是使用核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的引物在玉祁红芹中扩增出的一条特异性条带，该扩增条带只出现在玉祁红芹中，而在其它水芹品种中没有。将该特异性条带进行克隆和测序获得其核苷酸序列。进一步的，一对能够鉴别玉祁红芹的SCAR引物，该引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所述。分布对应于SEQIDNO:2片段的50-75nt及1096-1119nt位点。进一步的，一种玉祁红芹的DNA分子鉴别方法，利用序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物，对待检水芹品种的8个个体DNA样品进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴别：电泳结果中出现一条1070bp条带的样品为玉祁红芹，而相同部位没有出现条带的样品则不是玉祁红芹。进一步的，该PCR反应体系为25µL，其中上下游引物各0.2μmolL，1.5mmolLMgCl2，0.5mmolLdNTPs，50mmolLTris-HClpH8.3，1U高保真酶PrimeStar；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53-55℃退火45s，72℃延伸2.0min，35个循环；最后72℃延伸10min；用0.8-1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。有益效果：本发明提供了一种可以快速、准确地鉴定玉祁红芹的ISSR-SCAR标记方法，该方法操作简单、灵敏度高、重复性好，能够实现对玉祁红芹的特异性鉴定，对于保护地理标志产品的种质资源具有重要的意义。附图说明图1是玉祁红芹和4个其它水芹品种的ISSR引物（SEQIDNO:1）扩增图谱。泳道1-5从左至右依次为：1为苏州圆叶芹，2为常熟白芹，3为玉祁红芹，4为梅南水芹，5为江阴青芹，泳道M为DNAMarker。图2是玉祁红芹和其它水芹品种各8个单株的ISSR-SCAR（SEQIDNO:3和SEQIDNO:4）检测图谱。A为玉祁红芹，B为苏州圆叶芹，C为常熟白芹；D为梅南水芹；E为江阴青芹。泳道1-8为该品种的8个不同单株，泳道M为DNAMarker。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。1、待检样品DNA的提取选取待检的植物生长状况良好的植株，每个样品采集8-10个个体（表1），采集健康嫩叶50mg，运用改进的CTAB法分别提取DNA，DNA样品于-20℃保存备用。表1实验材料表。2、ISSR引物的筛选以提取的基因组DNA为模板~20ng，25µLPCR反应体系含有：上下游引物各0.2μmolL，1.5mmolLMgCl2，0.5mmolLdNTPs，50mmolLTris-HClpH8.3和1U高保真酶PrimeStarTaKaRa公司。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53-55℃退火45s，72℃延伸2.0min，35个循环；最后72℃延伸10min。用0.8%-1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR反应在BioMetraT1型PCR仪上进行，25µLPCR反应体系含有：上下游引物各0.2μmolL，1.5mmolLMgCl2，0.5mmolLdNTPs，50mmolLTris-HClpH8.3和1U高保真酶PrimeStarTaKaRa公司。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53-55℃退火45s，72℃延伸2.0min，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经0.8%-1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。3、ISSR-SCAR克隆及测序经过筛选96条ISSR引物，其中序列SEQIDNO:1的引物能在玉祁红芹中扩增出特异性条带。利用上海捷瑞生物工程有限公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）对该特异性条带进行回收、纯化。连接反应参照pMD19-TVector（购自Takara公司）说明书，反应体系10µL，包括以下组分：Vector1µL，SolutionI5µL，DNA4µL，4℃过夜连接。次日，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自Takara公司）。具体步骤为：取5µL连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加500µL液体SOC溶液，于37℃，180rpm的摇床中培养1小时，涂平板，放在培养箱中过夜培养。次日，挑取单菌落，用通用引物M13和RV-M进行菌落PCR检验，将含有正确条带的克隆交由南京锐真生物技术有限公司进行测序。4、ISSR-SCAR标记的验证根据本发明中玉祁红芹的特异性序列SEQIDNO:2，设计出一组特异性引物（SEQIDNO:3和SEQIDNO:4）用于SCAR反应。具体为：以玉祁红芹和其它4个水芹品种为待检样品，每个品种随机选取8个个体，用合成的SCAR引物进行品种特异性单株验证，反应体系为25µL，其组分及终浓度为：上下游引物各0.2μmolL，1.5mmolLMgCl2，0.5mmolLdNTPs，50mmolLTris-HClpH8.3和1U高保真酶PrimeStarTaKaRa公司。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53-55℃退火45s，72℃延伸2.0min，35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经0.8%-1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。序列表苏州市种子管理站江苏省中国科学院植物研究所一种鉴定玉祁红芹的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法2019-08-194SIPOSequenceListing1.0115DNA人工序列化学合成1ggagaggagaggaga1521148DNA玉祁红芹Oenanthejavanica2gtcgacgattggagaggagaggagatcatttggtttatcatattaagtcggaagagttta60ggtaagactttctcgttatttactagacatctaggcgaaccggcatagcgcttcgcttcc120ggttcttcggaagaaagttaaaagagaagaactggtcaactcctaggatcgggttgacac180tccataggactgtgagtccaactgtggctacatcgaagagtttggaaagaattcgggaac240agaaggactcgtgattcttctgaactggagttcagtagacctattcaccacggtccactc300gggcggtagccctgcattttgatagtcaaaaagccaagtacttaaagccttatcagttag360acccattttgcattattattgtcctataataatactcgactagggacctttaagaatatg420atatattatataatctcaagttcaagtcatgtacttaaactatacaatgtgtatcatgat480tctaaggacatttatcatgctaacaaatatgtcgcagtaattaaagtcataataaatacg540tttattgaataatcaattgacataaaggtttatcaaaagaaacattgtattgcctctagg600gcacctacaccaacaatctcccacttgcactagagccaatcacccatggatctagtaccc660atggaactagtgtgaccgtcgtgcttcttctgcgacaagcctttggtcagtgggtctgca720atgttatcatttgtgtgcactttacatatatgtatgtcaccccttccattaatctctcga780atgaggtgatatctcttgagtatatgtttggttcgggagtgagctctaggttctttagct840tgttcaatggctccattattatcgcagtatagatcaatgggatctgtaattgatggaacc900actcccaaattagtaatgaattttcaaatccaaacagcttccttagctgcttcacaagct960gcaatgtactcagcctccattgtagaattagctactgtttcttgctttgaactcttccaa1020cttacagtacctccgtttagacaaaacacaaaactagactgtgatacagtaccatccctg1080tctgtttggaaatttgcatcagtgtaaccttttacaaccagtttctcctctcctctccaa1140tctctaga1148326DNA人工序列化学合成3ggaagagtttaggtaagactttctcg26424DNA人工序列化学合成4ggttgtaaaaggttacactgatgc24

权利要求：1.能够在玉祁红芹中扩增出特异性条带的ISSR引物，其特征在于该引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述。2.能够在玉祁红芹中扩增得到的特异性DNA片段，其特征在于该片段的核苷酸序列如SEQIDNO:2所述。3.一对能够鉴别玉祁红芹的SCAR引物，其特征在于该引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所述。4.一种玉祁红芹的DNA分子鉴别方法，其特征在于利用序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物，对待测样本的DNA样品进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴别：电泳结果中出现一条1070bp条带的样品为玉祁红芹，而相同部位没有出现条带的样品则不是玉祁红芹。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于该PCR反应体系为25µL，其中上下游引物各0.2μmolL，1.5mmolLMgCl2，0.5mmolLdNTPs，50mmolLTris-HClpH8.3，1U高保真酶PrimeStar；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53-55℃退火45s，72℃延伸2.0min，35个循环；最后72℃延伸10min；用0.8-1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

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