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申请/专利权人：海南大学

摘要：本发明涉及一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法，以百香果子叶为实验材料，利用酶裂解法获得活性较高的叶肉原生质体，随后利用PEG介导的转化方法将外源基因高效转入百香果原生质体进行瞬时表达。包括1分离，选取生长状况良好的百香果植株子叶，去除下表皮；将除去下表皮的子叶放入酶解液中，得到含叶肉原生质体的酶解混合液；洗涤酶解混合液、过滤离心得到原生质体沉淀，重悬后获得原生质体悬浮液。2转化，利用PEG介导的转化方法成功将带有GFP标签的质粒转化到百香果原生质体中，转化效率达到60％。本发明建立了第一个高效的百香果原生质体分离和转化方法。该方法将应用于百香果的各种生物学研究，如基因功能分析、基因组编辑、蛋白质转运与定位、蛋白质‑蛋白质相互作用等。

主权项：1.一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选取生长状况良好的百香果植株子叶，将纸质胶带贴在上表皮表面，轻轻按压，从没有粘在胶带上的叶片那边小心地撕掉下表皮，剥皮后的叶片仍然粘在纸质胶带上，剪成小块，转移到含有2mL酶解液的培养皿中，用锡纸盖住培养皿，室温下在水平摇床45rpm上酶解1-2小时，原生质体释放到溶液中后，呈现出明显的绿色；S2、加入2mL冰的W5溶液，混匀后用100μm尼龙膜过滤，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清，保留原生质体颗粒；S3、水平地将1mL冰的W5溶液慢慢加入试管的内侧，轻轻地旋转使原生质体悬浮，1200rpm离心2分钟，用移液器小心地吸掉上清；S4、加入300μL冰的W5溶液使原生质体悬浮，吸10μL至血球计数板中计数，剩余的冰置30分钟；S5、小心移出上清，在室温下用MMg溶液重悬原生质体至密度为2～5×105mL；得到百香果原生质体悬浮液；S6、在2mL圆底离心管底部加入30μL的百香果原生质体悬浮液，加入3μLpGreen0029-GFP质粒，轻轻晃匀后加入33μL新配制的PEG溶液，再次轻轻晃匀，室温孵育10分钟；S7、加入120μLW5停止转染，并温和地晃动使其混匀；S8、1200rpm离心2分钟，小心吸掉上清，用60μLW5溶液悬浮原生质体；S9、1200rpm离心2分钟，吸掉上清，最后加入50μl的W5，在黑暗条件下培养。

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百度查询： 海南大学 一种百香果叶肉原生质体的分离和转化方法