申请/专利权人：中国农业大学

申请日：2019-06-10

公开（公告）日：2023-09-05

公开（公告）号：CN110178721B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;A01H1/02;A01H5/00;A01H6/46

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.09.05#授权;2019.09.24#实质审查的生效;2019.08.30#公开

摘要：本发明公开了形态标记法扩繁植物核雄性不育系；本发明提供了本发明提供的方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括：a提供第一植株，其包含使植物雄性不育的纯合隐性等位基因；b提供第二植株，该植株包含同所述第一植株相同使植物雄性不育的纯合隐性等；c用所述第二植株的雄性配子与所述第一植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。本发明提供方法可以扩繁植物核雄性不育种子，为杂交制种带来便利。该体系主要是利用一个可以分辨植株或种子颜色的核苷酸序列和一种细胞核雄性不育基因的野生型等位基因及转基因技术，转基因的籽粒可以通过颜色分辨。

主权项：1.一种方法，用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括：a提供第一植株，其包含使植物雄性不育的纯合隐性等位基因；b提供第二植株，该植株包含同所述第一植株相同使植物雄性不育的纯合隐性等位基因，并且含有下述构建体，所述构建体在所述第二植株中以杂合状态存在，所述构建体包含：i.第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时将恢复所述第一植株雄性生育力；ii.第二核苷酸序列，当其以杂合状态存在时即可影响植株形态，通过肉眼或仪器可以分辨含有该构建体的植株或籽粒和不含有该构建体的植株或籽粒；所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列紧密相连，这两个核苷酸序列在植株中同时存在；c用所述第二植株的雄性配子与所述第一植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代；所述影响植株形态为改变植株颜色或改变籽粒颜色或改变植株萎蔫程度；所述第一植株为玉米雄性不育突变体ms45；和，所述第一核苷酸序列包括控制雄性生育能力的基因；所述控制雄性生育能力的基因为Ms45基因表达元件，所述Ms45基因表达元件在所述第一植株中表达蛋白质Ms45；所述蛋白质Ms45为序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白；所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株颜色或籽粒颜色或植株萎蔫程度；所述第二核苷酸序列包括控制植株颜色或籽粒颜色或植株萎蔫程度的基因；所述方法为扩繁植物雄性不育系的方法；所述控制植株颜色或籽粒颜色的基因为花青素合成的关键基因Lc或叶绿素合成基因Oy1；或，所述控制植株萎蔫程度的基因为Wi2基因；所述基因Lc在所述第二植株中表达蛋白质LC；所述基因Oy1在所述第二植株中表达蛋白质Oy1；所述基因Wi2在所述第二植株中表达蛋白质Wi2；所述蛋白质LC为序列4所示的氨基酸残基组成的蛋白；所述蛋白质Oy1为序列7所示的氨基酸残基组成的蛋白；所述蛋白质Wi2为序列8所示的氨基酸残基组成的蛋白；所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的籽粒或植株是否紫色；或所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株是否黄色；或所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株是否萎蔫。

全文数据：形态标记法扩繁植物核雄性不育系技术领域本发明涉及一种扩繁植物核雄性不育系的方法，尤其涉及形态标记法扩繁植物核雄性不育系，该方法利用细胞核雄性不育基因、控制植株颜色或控制种子颜色或调控植株萎焉的基因及转基因技术扩繁植物雄性不育系，属于植物遗传育种及种子生产领域。背景技术由于杂种优势的存在，使得杂交种的生物量、抗病虫能力、耐胁迫干旱、高温、低温、盐碱等能力较其双亲有相当的提升，如杂交玉米、杂交水稻的产量远远高于纯合的双亲。生产杂交种通常采用的方法为：将雌性亲本和雄性亲本种在一起，将雌性亲本的雄穗去除，而保留雄性亲本的雄穗，雌性亲本收获的种子即为杂交种。自然界中的植物存在自花授粉、异花授粉及常异花授粉三种类型，自花授粉指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。在两性花的植物中，又可分为同一花的雄蕊与雌蕊间进行授粉的同花授粉菜豆属和在一个花序个体中不同花间进行授粉的邻花授粉，以及同株不同花间进行授粉的同株异花授粉。有的植物雄蕊和雌蕊不长在同一朵花里，甚至不长在同一棵植株上，无法自花授粉，它们的雌蕊只能得到其他花的花粉，这叫做异花授粉。将天然杂交率高于50％且自交衰退的一类作物归为常异花授粉作物，如玉米。玉米为雌雄同株，并且雌雄花位于植株的不同部位，玉米既可通过自花授粉也可通过异花授粉繁衍后代，自然条件下，当风将花粉从雄穗吹到雌穗的花丝上时即完成了天然授粉。在玉米育种中首先应开发出纯合的玉米自交系，然后将两个自交系进行杂交，对杂交的后代进行产量、抗逆性等进行评估，以确定其是否具有商业化潜力。其中每个自交系都可能具有另一个自交系所缺乏的一种或多种优良性状，或补充另一个自交系的一种或多种不良性状。两个自交系杂交的第一代种子为F1代种子，F1代的种子发芽后获得F1代植株，F1代植株较两个自交系亲本父母本更健壮，同时拥有更多的生物量。可以通过对母本人工去雄来生产杂交种，即将未散粉的母本其可与父本在田间间隔播种，如播种5行母本，一行父本雄穗去除，保留父本雄穗。随后，只要对外来玉米花粉进行隔离，母本雌穗只能接受父本的花粉，得到的种子即为杂交种F1，该杂交种即可用于农业生产。在生产杂交种的过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，以上两种情况均能导致母本自交授粉，致使生产的杂交种中混杂了母本自交系的种子，母本自交系的产量远低于杂交种的产量，这样的种子为不合格产品，即会影响农民收入又会影响制种公司信誉，严重的将导致制种公司承担相应的赔偿责任。也可采用机器对母本进行去雄，机器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快并且成本更低。然而，较之手工去雄，大多数去雄机器会对植株造成更大的破坏，因此，目前没有令人完全满意的去雄手段，人们仍在寻找成本更低，去雄更彻底的替换方法。稳定的雄性不育系统提供了简单高效的手段，通过使用核-质互作雄性不育CMS自交系，可以在一些基因型中得以避免繁重的去雄工作。该手段包括三个主要材料，即不育系：雄性不育材料，保持系：可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系，恢复系：可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生F1，即用于农业生产的杂交种。更具体的说，核-质互作不育型，表现为核-质互作遗传。不但需要细胞质有不育基因S，而且需要细胞核里有纯合的不育基因rfrf，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。如胞质基因为可育N，则不论核基因是可育RfRf还是不育rfrf，都表现为雄性可育。同样，如核里具有可育基因RfRf或Rfrf，则不论胞质基因是可育N还是不育S，也都表现为雄性可育。这种由核-质互作形成的雄性不育系，其遗传组成为Srfrf，不能产生正常的花粉，但可作为杂交母本。由于能找到保持系Nrfrf[用它与不育系杂交，所产生的F1仍能保持雄性不育，即：Srfrf♀×Nrfrf→Srfrf不育]并能接受恢复系SRfRf或NRfRf[用它们与不育系杂交，所产生的F1都是可育的，即：Srfrf♀×SRfRf→SRfrfF1可育，或Srfrf♀×NRfRf→SRfrfF1可育]的花粉，使F1恢复为雄性可育，F1植株自交产生F2，所以在农业生产上可以广泛应用。雄性不育系可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、蓖麻、甜菜和油菜等作物已经利用核质互作雄性不育进行杂交种子的生产；对其他作物的核-质互作雄性不育系，也正在进行广泛的研究。CMS也有它的缺陷，一是观察到个别CMS材料容易感病，二是恢复系比较难寻找，这些问题阻碍了CMS系统在制种中的广泛应用。Braretal的美国专利4654465和4727219中公开了一种类型的遗传不育性。但是，这种类型的遗传不育需要在基因组内的多个不同位点保持相应的基因型，需要每代对这些位点进行分子标记跟踪检测。Patterson还描述了一种可能有用的染色体易位基因系统，但该系统更为复杂见美国专利No.3861709和3710511。人们一直在尝试对雄性不育系统进行优化，例如，Fabijanski,etal.开发了使植物雄性不育的方法EPO893010153.8公开号329308和作为WO9008828公开的PCT申请PCTCA9000037。主要是通过以下两种途径抑制植株的雄花育性，一种方法是将雄性组织特意表达的启动子与细胞毒素基因相连转入植株中，使雄花不能正常散粉同时不影响其他性状；另一种是通过基因干扰手段，将已经克隆的控制植株雄花育性的基因通过转基因的手段将其干扰，从而使其不能正常行使功能。还有通过一些基因调控元件来抑制基因表达，从而影响植株育性的手段WO9008829。在多数情况下，只有控制雄性不育的核基因隐性纯合msms植株才会表现为雄性不育，由于雄性不育植株无法自交，因此只能通过杂合植株Msms与其杂交，才会得到雄性不育植株msms。并且在同一果穗上雄性不育籽粒msms与可育的杂合籽粒Msms同时存在，通过籽粒无法分辨哪些是不育籽粒，哪些是可育籽粒，只能通过播种后，植株散粉时才可分辨。近年来，也有利用转基因的手段来保持雄性不育植株的不育性US6743968。该方法将花粉致死基因与雄性生育能力恢复基因构建在一个载体中，导入雄性不育植株中，转基因后代表现为可育，但只能产生不含恢复基因的花粉。当这样的植株与雄性不育植株杂交，便保持了隐性不育植株的纯合隐性状态。其首先构建一个转基因载体，该载体含有一个花粉细胞致死基因，同时该载体还含有一个恢复植株育性的显性基因。将该载体转入雄性不育植株，并且该载体在转基因植株中以杂合状态存在，由于恢复育性基因的存在使得植株可育，当其与雄性不育植株杂交，由于含有恢复基因的花粉Msms同时含有致死基因，使得花粉败育，因此只有不含恢复基因的花粉ms才能与雄性不育植株雌配子ms进行杂交，后代均为隐性纯合个体msms。如前文所述，采用雄性不育系统制种的很多工作的一个重要问题在于如何利用雄性不育基因及如何分辨雄性不育种子、植株及可育种子、植株，同时还需要考虑如何将不育个体的不育性保持下来。在玉米中已经鉴定了多种雄性不育突变体Skibbeetal.2005，具体见下表:表1由核基因引起的雄性不育突变体以上这些基因已经陆续被克隆，如ms45Albertsenetal.1993和ms26PTCUS2006024273，同时，水稻中也有一些雄性不育基因被陆续克隆，如dpwJingShietal.2011以及拟南芥中鉴定到的一些雄性不育基因，如Aarts,etal.1993。发明内容为了用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，本发明提供如下技术方案：本发明的一个目的是提供一种方法。本发明提供的方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括：a提供第一植株，其包含使植物雄性不育的纯合隐性等位基因实施例中纯合隐性等位基因具体为ms45ms45；b提供第二植株，该植株包含同所述第一植株相同使植物雄性不育的纯合隐性等位基因，并且含有下述构建体，所述构建体在实施例为转基因元件Ms45-Lc或Ms45-Oy1或Ms45-Wi2在所述第二植株中以杂合状态存在杂合Ms45-Lc-或Ms45-Oy1-或Ms45-Wi2-插入片段仅存在于一条染色单体中，其姊妹染色单体不含有转基因元件，所述构建体包含：i.第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时将恢复所述第一植株雄性生育力；ii.第二核苷酸序列，当其以杂合状态存在时即可影响植株颜色如Lc基因使植株和或籽粒变为紫色，或，Oy1基因使植株变为黄色或影响植株形态如Wi2基因使植株顶部叶片萎蔫，通过肉眼或仪器可以分辨含有该构建体的植株或籽粒和不含有该构建体的植株或籽粒；所述第一核苷酸序列实施例中为序列1所示的Ms45基因表达元件与所述第二核苷酸序列实施例中为序列2所示的Lc基因或序列5所示的Oy1基因或序列6所示的Wi2基因紧密相连，这两个核苷酸序列在植株中同时存在在本发明的实施例中称之为转基因元件Ms45-Lc、Ms45-Oy1或Ms45-Wi2；c用所述第二植株的雄性配子与所述第一植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。上述方法为扩繁植物雄性不育系的方法；和或，所述植物、所述第一植株和所述第二植株均为双子叶植物或者单子叶植物；和或，所述植物、所述第一植株和所述第二植株均不仅可为玉米Zeamays，同样可为水稻Oryzasativa、高粱Sorghumbicolor、小麦Triticumaestivum、大豆Glycinemax、棉花Gossypiumhirsutum、向日葵Helianthusannuus等作物。上述方法中，所述第一核苷酸序列包括控制雄性生育能力的基因，如表1中的ms45的野生型等位基因Ms45，这个控制雄性生育能力的基因不限于表1中列出的基因，玉米中或其他物种中控制雄性生育能力的基因也可达到本发明的目的，因此也在本发明的保护范围内。上述方法中，在本发明的实施例中，所述第一植株为玉米雄性不育突变体ms45，具体为ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45，其源自ms45纯合隐性突变体MaizeGeneticsCooperationStockCenter，905I；突变位点在表1中记载ms45和郑58zheng58的回交后代。所述第一核苷酸序列在本发明的实施例中为Ms45基因表达元件，所述Ms45基因表达元件在所述第一植株中表达蛋白质Ms45。所述蛋白质Ms45为如下a或b：a序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列3具有相同功能的蛋白质。上述方法中，所述Ms45基因表达元件包括Ms45基因启动子、Ms45基因5’UTR、Ms45基因外显子、Ms45基因内含子、Ms45基因3’UTR和Ms45基因终止子；所述Ms45基因表达元件为如下1或2或3所示的DNA分子：1编码区包括序列1的DNA分子；2编码区为序列1的DNA分子；3将1或2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与1或2具有相同功能的DNA分子。上述方法中，所述第二核苷酸序列包括控制植株颜色或控制植物籽粒颜色或控制植株萎蔫程度的基因；上述方法中，所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株影响所述第二植株颜色或籽粒颜色或植株萎蔫程度：本发明的一个实施例中，上述控制植株颜色或控制植物籽粒颜色的基因为花青素合成的关键基因Lc；上述花青素合成关键基因Lc在所述第二植株中表达蛋白质LC。所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株影响所述第二植株的籽粒或植株颜色是否紫色；含有第二核苷酸序列，则籽粒或植株颜色为紫色，不含有，则籽粒或植株颜色为非紫色；本发明的另一个实施例中，上述控制植株颜色的基因为叶绿素合成相关基因Oy1；上述Oy1基因在所述第二植株中表达蛋白质Oy1。所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株颜色是否黄色；含有第二核苷酸序列，则植株颜色为黄色，不含有，则植株颜色为非黄色；本发明的另一个实施例中，上述控制植株萎蔫程度的基因在本发明的实施例中为Wi2基因；上述Wi2基因在所述第二植株中表达蛋白质Wi2。所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株是否萎蔫；含有第二核苷酸序列，则植株萎蔫，不含有，则植株为非萎蔫。上述蛋白质LC为如下a或b：a序列4所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列3具有相同功能的蛋白质；或，所述蛋白质Oy1为如下a或b：a序列7所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列7具有相同功能的蛋白质；或，所述蛋白质Wi2为如下a或b：a序列8所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列8具有相同功能的蛋白质。所述基因Lc为如下1或2或3所示的DNA分子：1编码区包括序列2的DNA分子；2编码区为序列2的DNA分子；3将1或2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与1或2具有相同功能的DNA分子。所述基因Oy1为如下1或2或3所示的DNA分子：1编码区包括序列5的DNA分子；2编码区为序列5的DNA分子；3将1或2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与1或2具有相同功能的DNA分子。所述基因Wi2为如下1或2或3所示的DNA分子：1编码区包括序列6的DNA分子；2编码区为序列6的DNA分子；3将1或2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与1或2具有相同功能的DNA分子。本发明涉及控制雄性生育能力、控制植株或种子颜色和控制植株萎焉的核苷酸序列，及利用这些核苷酸序列和转基因技术开发的扩繁植物雄性不育的方法。本发明的上述方法可以用于如下目的：一个目的在于提供一种高效的种子标记方法，利用该方法可以扩繁植物雄性不育种子，为杂交制种节约人力，降低成本，保证种子纯度。另一目的是提供一种通过植株或种子颜色或植株萎蔫程度高效分辨可育籽粒及不育籽粒的方法。还一目的是提供一种转基因植株，该植株可以保持雄性不育植株的不育性。本发明另一个目的是提供一种DNA构建物。本发明提供的构建物如上述方法中所述的构建体。上述DNA构建物可以恢复雄性不育突变体的育性，同时改变植株颜色或改变植株籽粒颜色或改变植株萎蔫程度。上述方法中所述的构建体如下：本发明构建了含有序列1所示的Ms45基因表达元件的植物表达载体，将该载体转入雄性不育突变体ms45中，可以恢复该突变体的育性。本发明构建了控制玉米花青素合成基因LcLudwigetal.1993的载体。该载体会影响花青素合成，过表达该基因使植株或籽粒表现为紫色。本发明构建了调控叶绿体合成的Oy1基因的载体。该载体会影响叶绿体合成，过表达该基因使植株变为黄色。本发明构建了调控根木栓质合成相关基因Wi2的载体。该载体会影响水分运输，过表达该基因使植株萎蔫顶部叶片萎蔫。本发明第3个目的是提供如下任一种的物质。本发明提供的如下物质：1一种植物，该植物如上述方法中所述的第二植株；2由1所述的植物产生的再生细胞的组织培养物；3由2所述的组织培养物产生的原生质体；4一种植物，所述植物是利用上述方法产生的纯合隐性的雄性不育植株。上述第二植株可以保持雄性不育植株的不育性。上述植株可为植株的全部或部分，如根、茎、叶、胚、根尖、花粉或花药等。利用上述方法产生的纯合隐性雄性不育植株在生产杂交种中的用途也是本发明保护的范围。本发明的关键是将雄性恢复基因Ms45、控制植株颜色或控制种子颜色或调控植株萎焉等控制植株形态的基因构建在一个载体中，该载体可以恢复雄性不育突变体ms45的育性，同时使含有转基因序列的植株颜色为所需颜色或所需植株萎焉状态，即对含有恢复基因的植株或籽粒进行标记，以便区分可育个体保持系和不育个体不育系。以Lc为例，本发明的一个实施例中，发明人利用控制植物雄性生育能力、过表达花青素合成相关基因Lc的核苷酸序列及转基因技术，发明了一种高效扩繁植物雄性不育系的新方法。控制植物雄性生育能力的基因包括表1中所列出的雄性不育基因及其他雄性不育基因以及其他物种的雄性不育基因。发明人首先构建了一个植物转化载体，该载体中包含恢复雄性生育能力基因的表达元件和过表达花青素合成相关基因Lc的表达元件，将该载体转入HiIIA×HiIIB玉米杂交种中，,该杂交种正常条件下，植株为绿色。然后利用雄性不育植株对获得的转基因植株进行回交，从而将控制植物雄性生育能力Ms45恢复基因、控制植株或种子颜色Lc基因的核苷酸序列导入雄性不育植株ms45中。由于存在恢复基因Ms45，转基因植株表现为可育。当转基因杂合体植株Msmsms与雄性不育植株msms杂交时，会产生以下两种后代，一种为绿色植株和黄色种子的雄性不育个体不育系，基因型为msms，不含有转基因序列的雄性不育正常籽粒不育系ms45ms45,该不育系可以被任意一种野生型植株恢复育性，在制种过程中可作为不育系；另一种为紫色植株或种子的可育籽粒保持系，基因型为Msmsms，该保持系在控制雄性生育能力位点为隐性纯合，由于含有可以互补的转基因序列，该植株表现为可育，由于同时含有控制植株或种子颜色花青素合成基因的核苷酸序列，该植株或种子颜色不同于野生型。以Oy1为例，本发明的一个实施例中，发明人利用控制植物雄性生育能力、过表达花青素合成相关基因Oy1的核苷酸序列及转基因技术，发明了一种高效扩繁植物雄性不育系的新方法。控制植物雄性生育能力的基因包括表1中所列出的雄性不育基因及其他雄性不育基因以及其他物种的雄性不育基因。发明人首先构建了一个植物转化载体，该载体中包含恢复雄性生育能力基因的表达元件和过表达叶绿素合成相关基因Oy1的表达元件，将该载体转入HiIIA×HiIIB玉米杂交种中,该杂交种正常条件下，植株为绿色。然后利用雄性不育植株对获得的转基因植株进行回交，从而将控制植物雄性生育能力Ms45恢复基因、控制植株颜色Oy1基因的核苷酸序列导入雄性不育植株ms45中。由于存在恢复基因Ms45，转基因植株表现为可育。当转基因杂合体植株Msmsms与雄性不育植株msms杂交时，会产生以下两种后代，一种为绿色植株的雄性不育个体不育系，基因型为msms，不含有转基因序列的雄性不育正常籽粒不育系ms45ms45,该不育系可以被任意一种野生型植株恢复育性，在制种过程中可作为不育系；另一种为黄色植株的可育籽粒保持系，基因型为Msmsms，该保持系在控制雄性生育能力位点为隐性纯合，由于含有可以互补的转基因序列，该植株表现为可育，由于同时含有控制植株或种子颜色控叶绿体合成相关基因的核苷酸序列，该植株颜色不同于野生型。以Wi2为例，本发明的一个实施例中，发明人利用控制植物雄性生育能力、过表达调控根木栓质合成相关的基因Wi2的核苷酸序列及转基因技术，发明了一种高效扩繁植物雄性不育系的新方法。控制植物雄性生育能力的基因包括表1中所列出的雄性不育基因及其他雄性不育基因以及其他物种的雄性不育基因。发明人首先构建了一个植物转化载体，该载体中包含恢复雄性生育能力基因的表达元件和过表达调控根木栓质合成相关的基因Wi2的表达元件，将该载体转入HiIIA×HiIIB玉米杂交种中，该杂交种正常条件下，植株为非萎蔫状态。然后利用雄性不育植株对获得的转基因植株进行回交，从而将控制植物雄性生育能力Ms45恢复基因、调控根木栓质合成Wi2的基因的核苷酸序列导入雄性不育植株ms45中。由于存在恢复基因Ms45，转基因植株表现为可育。当转基因杂合体植株Msmsms与雄性不育植株msms杂交时，会产生以下两种后代，一种为非萎蔫状态或者萎蔫程度低于保持系的雄性不育个体不育系，基因型为msms，不含有转基因序列的雄性不育正常籽粒不育系ms45ms45,该不育系可以被任意一种野生型植株恢复育性，在制种过程中可作为不育系；另一种为植株叶片萎蔫的可育籽粒保持系，基因型为Msmsms，该保持系在控制雄性生育能力位点为隐性纯合，由于含有可以互补的转基因序列，该植株表现为可育，由于同时含有控制植株或种子颜色花青素合成基因的核苷酸序列，该植株萎蔫程度不同于野生型。本发明的其他目的在下文说明书和权利要求书中将是显而易见的。本发明的实验证明，本发明提供方法可以扩繁植物核雄性不育种子，为杂交制种带来便利。该体系主要是利用一个可以分辨植株或种子颜色或调控植物萎蔫的核苷酸序列和一种细胞核雄性不育基因的野生型等位基因及转基因技术。转基因的籽粒可以通过颜色分辨，转基因植物或可以通过颜色区分植株，或可以通过萎蔫程度区分植株。附图说明图1为雄性生育力突变体ms45A及野生型Ms45B的雄花表型。图2为过表达Lc基因籽粒表型，紫色为含有Lc基因籽粒B，非紫色为不含有Lc基因籽粒A。图3为过表达Lc基因植株表型，紫色为含有Lc基因幼苗，绿色为不含有Lc基因幼苗。图4为含有雄性生育力基因Ms45基因表达元件及过表达Lc基因元件的植物表达载体。图5为转化雄性生育力基因Ms45基因表达元件及过表达Lc基因载体植株的雄花表型。图6为利用细胞核雄性不育基因、过表达Lc基因及转基因技术制种的路线图。图7为含有转基因元件Ms45-Oy1的杂交后代和不含有转基因元件Ms45-Oy1杂交后代对比图。图8为含有转基因元件Ms45-Wi2的杂交后代和不含有转基因元件Ms45-Wi2杂交后代对比图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义，除非特殊说明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公认的标准技术，材料，方法和例子仅作阐述，不加以限制。细胞核雄性不育是由于小孢子形成过程中的关键基因被突变、抑制或受到其他影响的结果，这些基因被统称为雄性不育基因。花粉发育途径中受到很多基因的控制，因此很多基因的突变最终都会导致雄性不育，目前在玉米中鉴定了大量的雄性不育突变体如表1所示，每个雄性不育基因都有其特定的恢复基因，即每种雄性不育突变体，只能被其野生型等位基因恢复。本发明以表1中的一个雄性不育突变体为例，如ms45，突变体雄花不能正常散粉图1所示，A为雄性不育突变体，B为野生型，该突变体育性可以被野生型植株中的Ms45基因恢复。本发明中野生型恢复基因Ms45来源于自交系B73，其序列见序列1，该序列包含Ms45基因完整表达元件，即包含启动子、5’UTR，外显子，内含子，3’UTR和终止子。将序列1所示的核苷酸转入ms45雄性不育突变体后，突变体植株变现为可育。本发明转化了控制植株颜色或控制种子颜色或调控植株萎焉的基因，其中：控制植株颜色或控制种子颜色的基因为Lc基因或Oy1基因；调控植株萎焉的基因为Wi2基因。本发明中的Lc基因核苷酸序列见序列2所示，其中包含外显子和内含子序列，该序列在植物体内可以间接成成熟的mRNA序列。本发明中的Oy1基因核苷酸序列见序列5所示，其中包含外显子和内含子序列，该序列在植物体内可以间接成成熟的mRNA序列。本发明中的Wi2基因核苷酸序列见序列6所示，其中包含外显子和内含子序列，该序列在植物体内可以间接成成熟的mRNA序列。下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，这并非意欲对本发明的范围加以限制。实施例1、构建包含雄性生育力基因Ms45和过表达调控相关性状基因元件及选择标记基因的植物转化载体本发明以表1中的ms45雄性不育突变体为例，具体阐述实施方案。一、Ms45野生型等位基因的扩增扩增ms45的野生型等位基因，该基因来源于自交系B73，其序列见序列1，具体方法如下：以玉米自交系B73的基因组DNA为模板，参考B73基因组序列www.maizesequence.org，设计引物对该基因的整个表达元件Ms45基因的启动子和编码框序列进行扩增，扩增引物如下：Ms45F:5'tgaattcTGCTGAGTTCTCCTTGGGTTATCC3',Ms45R:5'tcccgggGGTTGCGCATGAAATAGGGGT3'。上游扩增引物的5’端添加了EcoRI酶切位点，下游扩增引物的5’端添加了SmaI酶切位点，扩增反应体系为：模板DNA2μL,引物Ms45F0.5μL，引物Ms45R0.5μL,dNTP1.6μL,10×Buffer2μL,高保真taq酶0.3μL,ddH2O13.1μL。反应条件为95℃预变性5min，95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸3min，32个循环，72℃后延伸10min。扩增的目标条带全长为3518bp,扩增后将该序列连接T-easy测序载体，转化得到阳性克隆，将阳性克隆进行测序，测序结果表明该3518bp的DNA片段由EcoRI识别位点、序列1所示的Ms45基因表达元件和SmaI识别位点组成，为Ms45基因表达元件，序列1所示的Ms45基因表达元件编码序列3所示的Ms45蛋白质。二、调控植株颜色和萎蔫的相关基因的合成1、调控植株颜色的Lc基因的人工合成本发明过表达参与花青素合成的关键基因Lc，该基因编码bHLH转录因子氨基酸序列4。该基因影响参与花青素的合成，影响植株或种子颜色，根据Ludwig,S.R.etal.1993对该基因的报道，及对该序列的说明GenBank:M26227.1对该基因进行了合成，同时在序列2所示的Lc基因的5’端添加了NcoI酶切位点和保护碱基，3’端添加了BstEII酶切位点和保护碱基。2、调控叶绿体合成的Oy1基因的人工合成Oy1基因的核苷酸序列为序列5所示，且在序列5所示的Oy1基因的5’端添加了NcoI酶切位点和保护碱基，3’端添加了BstEII酶切位点和保护碱基。Oy1基因表达序列7所示的Oy1蛋白。3、调控植株萎蔫的Wi2基因的人工合成调控根木栓质合成的Wi2基因表达可以影响水分运输从而使植株更容易萎蔫。Wi2基因的核苷酸序列为序列6所示，且在序列6所示的Wi2基因的5’端添加了NcoI酶切位点和保护碱基，3’端添加了BstEII酶切位点和保护碱基。Wi2基因表达序列8所示的Wi2蛋白。三、构建包含雄性生育力基因Ms45和过表达调控植株颜色和形态的相关基因元件及选择标记基因的植物转化载体以质粒pCAMBAI3301国际农业分子生物学应用中心CAMBIA,Australia为骨架DNA，该载体上含有选择标记基因bar，利用该载体骨架构建如下植物表达载体：1、植物表达载体pMs45-Lc植物表达载体pMs45-Lc包含雄性生育力基因Ms45和过表达Lc基因元件及选择标记基因bar，具体为将序列2所示的Lc基因替换pCAMBAI3301载体的BstEII和NcoI酶切位点间的DNA分子，且将序列1所示的Ms45基因表达元件替换pCAMBAI3301载体的EcoRI和SmaI酶切位点间的DNA分子，该植物转化载体表达转基因元件Ms45、Lc和载体本身的选择标记基因bar。上述构建植物表达载体的方法如下：首先利用BstEII和NcoI分别双酶切上述二获得的Lc基因和pCAMBAI3301空载体，再将酶切后的Lc基因和酶切后pCAMBAI3301空载体骨架连接，得到中间载体；再用EcoRI和SmaI双酶切中间载体和上述一获得的Ms45基因表达元件，连接，得到重组载体pMs45-Lc。该载体的结构示意图如图4所示。2、植物表达载体pMs45-Oy1植物表达载体pMs45-Oy1为将序列5所示的Oy1基因替换pCAMBAI3301载体的BstEII和NcoI酶切位点间的DNA分子，且将序列1所示的Ms45基因表达元件替换pCAMBAI3301载体的EcoRI和SmaI酶切位点间的DNA分子，该植物转化载体表达转基因元件Ms45、Oy1和载体本身的选择标记基因bar。3、植物表达载体pMs45-Wi2植物表达载体pMs45-Wi2为将序列6所示的Wi2基因替换pCAMBAI3301载体的BstEII和NcoI酶切位点间的DNA分子，且将序列1所示的Ms45基因表达元件替换pCAMBAI3301载体的EcoRI和SmaI酶切位点间的DNA分子，该植物转化载体表达转基因元件Ms45、Wi2和载体本身的选择标记基因bar。实施例2、植物转化载体转化玉米获得转基因玉米一植物转化载体转化玉米本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法获得转基因植株。分别将实施例1的植物转化载体pMs45-Lc、pMs45-Oy1和pMs45-Wi2转化农杆菌EHA105，得到含有不同转基因元件的农杆菌，再分别用含有不同转基因元件的农杆菌侵染玉米幼胚，具体如下：将实施例1的植物转化载体pMs45-Lc转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105pMs45-Lc。将实施例1的植物转化载体pMs45-Oy1转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105pMs45-Oy1。将实施例1的植物转化载体pMs45-Wi2转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105pMs45-Wi2。实验室在转基因过程中所用受体为自交系HiIIA和HiIIB的杂交F1代。玉米自交系HiIIA和HiIIBArmstrongCL,GreenCEandPhillipsRL.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformationresponse.MaizeGeneticsCooperationNewsLetter,1991,65:92-93。首先在田间种植玉米自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，有两种授粉方式：HiIIA作母本，HiIIB作父本；HiIIA作父本，HiIIB作母本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟杂交幼胚；然后在室内进行根癌农杆菌EHA105侵染，将被根癌农杆菌EHA105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到转基因T0代植株。获得转基因T0代以后，用T0代转基因植株的花粉对一些制种母本及Ms45雄性不育材料进行杂交，并观察表型。采用根癌农杆菌EHA105侵染法将实施例1的植物转化载体pMs45-Lc、pMs45-Oy1和pMs45-Wi2导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法为：具体方法为：一、剥离幼胚1、去除苞叶。切除HiIIA和HiIIB的杂交F1代果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗。2、向烧杯里加约700ml的消毒液50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween20用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。3、把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部1.5-1.8mm，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等4、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间,然后轻轻向上撬出幼胚,用小的手术刀尖轻轻托起幼胚,确保幼胚不受到任何的损伤,把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基,胚的密度大约是2X2cm30个皿5、用封口膜封住培养皿，28度暗培养2-3天二、农杆菌浸染1、重组农杆菌要在YEP含Kana33mgL和Str100mgL抗生素培养基上提前一周培养，并在4度冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80度甘油保存2、重组农杆菌要在YEP培养基上在19℃培养3天，同时加Kana33mgL,Str50mgL。3、3天以后，挑取重组农杆菌放入含有5mL浸染培养基的50ml离心管中,同时加100uMASinf+AS,在室温25度转速75rpm摇菌2-4个小时。4、浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基2ml的离心管中，每管约20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5ml特定浓度OD550＝0.3-0.4的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。上述重组农杆菌分别为EHA105pMs45-Lc、EHA105pMs45-Oy1和EHA105pMs45-Wi2。三、共培养1、浸染以后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基溶质如表2，溶剂为水,使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌；2、用封口膜封住培养皿，在20度条件下暗培养3天。四、静息培养1、共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基溶质如表2，溶剂为水上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28度条件下暗培养7天。五、选择1、7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基溶质如表2，溶剂为水上面35个幼胚每皿，培养两周，选择培养基含有双丙胺磷1.5mgL,两周后再进行亚培养双丙胺磷的浓度可以上升到3mgL。2、浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的Ⅱ型愈伤组织。六、转基因植株的再生1、在再生培养基I溶质如表2，溶剂为水上面长3周，然后在再生培养基II溶质如表2，溶剂为水上面发芽在光照培养室，得到T0代转pMs45-Lc玉米、T0代转pMs45-Oy1玉米和T0代转pMs45-Wi2玉米。2、待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。表2.培养基的溶质及含量表2中，MS盐购自phytoTechnologyLaboratories公司，货号为M524。二、分析获得的转基因植株针对植株整体形态对来自一的T0代转pMs45-Lc玉米、T0代转pMs45-Oy1玉米和T0代转pMs45-Wi2玉米及其后代加以评估，针对花粉、植株和籽粒表型进行分析。将一得到的T0代转pMs45-Lc玉米、T0代转pMs45-Oy1玉米和T0代转pMs45-Wi2玉米分别与ms45纯合隐性突变体ms45雄性不育材料，MaizeGeneticsCooperationStockCenter，905I杂交，得到杂交后代。1、检测杂交后代的基因型通过bar基因的检测确定是否含有转基因元件Ms45-Lc、Ms45-Oy1或Ms45-Wi2；bar基因检测方法：用如下引物Bar669F和Bar669R:对杂交后代进行PCR扩增，若含有大小669bp目的片段，则杂交后代为含有转基因元件的杂交后代，若不含有大小669bp目的片段，则杂交后代为不含有转基因元件杂交后代。上述引物Bar669F和Bar669R序列如下：Bar669F:5'TCTCGGTGACGGGCAGGAC3'Bar669R:5'TGACGCACAATCCCACTATCCTT3'得到含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代、含有转基因元件Ms45-Oy1的杂交后代和含有转基因元件Ms45-Wi2的杂交后代。2、检测杂交后代的表型观察大田中各个含有相应转基因元件的杂交后代的表型，结果如下：1含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代植株颜色判断育性结果如图5所示，含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代如图5A所示，杂交后代中含有Ms45-Lc的植株表现为紫色检测可育；而不含有转基因元件Ms45-Lc杂交后代的植株表现为非紫色检测完全不育,如图5B所示。籽粒颜色判断育性结果如图2所示，图2B为含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代籽粒颜色为紫色检测可育，图2A为不含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代籽粒颜色为黄色非紫色，检测不育；幼苗颜色判断育性结果如图3所示，紫色为含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代幼苗检测可育，黄色非紫色，检测不育为不含有转基因元件Ms45-Lc的杂交后代幼苗。这表明Ms45基因的表达互补了隐性纯合ms45雄性不育表现，同时，含有Ms45-Lc的转基因植株或籽粒表现紫色。这表明Lc基因在转基因植株中均能正常行使功能。同时对通过籽粒表型鉴定的紫色籽粒及正常籽粒播种到田间，这些籽粒均能够正常发芽，出芽率与正常籽粒没有显著差异。当植株生长至4-5片叶时，喷施200mM的双丙胺磷，紫色幼苗均能正常成活，并且生长不受到抑制。而正常籽粒出的苗全部死亡。这表明选择标记基因bar、Ms45雄性生育力基因及过表达Lc基因均能正常行使功能，并且这三个基因连锁遗传。当转基因植株与雄性不育突变体ms45杂交产生的后代中，正常籽粒：紫色籽粒为1:1，紫色籽粒后代均为紫色幼苗。2含有转基因元件Ms45-Oy1的杂交后代植株颜色判断育性结果如图7所示，含有转基因元件Ms45-Oy1的杂交后代如图7A所示，杂交后代中含有Ms45-Oy1的植株表现为黄色，由于含有Ms45，植株表现为可育检测可育；而不含有转基因元件Ms45-Oy1杂交后代如图7B所示，植株表现为绿色，由于不含有Ms45而表现为不育检测不育。3含有转基因元件Ms45-Wi2的杂交后代植株萎蔫程度判断育性结果如图8所示，含有转基因元件Ms45-Wi2的杂交后代如图8A所示，杂交后代中含有Ms45-Wi2的植株表现为萎蔫，由于含有Ms45，植株表现为可育检测可育；而不含有转基因元件Ms45-Wi2杂交后代的植株如图8B所示,表现为正常，由于不含有Ms45而表现为不育检测不育。实施例3、使用雄性不育保持系对ms45雄性不育自交系进行大规模扩繁一Ms45Ms45野生型自交系转变为第一植株ms45ms45纯合隐性自交系以ms45纯合隐性突变体MaizeGeneticsCooperationStockCenter，905I，为母本，与自交系如郑58zheng58杂交，获得的F1继续与玉米自交系郑58河南省农科院粮作所回交，对获得的BC1群体进行基因型分析，筛选Ms45位点为杂合的植株继续与郑58回交，如此回交5-6代后，利用分子标记筛选Ms45位点为杂合，农艺性状表型与郑58接近的单株进行自交，从而获得ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45，该自交系即可作为不育系，将其称为第一植株；上述筛选Ms45位点的基因型的方法如下：用如下引物Ms45F和Ms45R进行PCR扩增，Ms45目的片段大小：859bp,ms45目的片段大小：811bp。若同时得到859bp和811bp目的片段，则为Ms45位点为杂合Ms45ms45，若无811bp片段，则Ms45位点为Ms45Ms45显性纯合；若无859bp目的片段，则为ms45ms45隐性纯合。Ms45F:5'CTTGAGCGACAGCGGGAACT3',Ms45R：5'TGTTGTTTCTTGGCAAAGGTCAG3'二、制备第二植株1、制备第二植株Ms45-Lc杂合且ms45纯合将一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45第一植株，母本与实施例2得到的T0代转pMs45-Lc玉米父本杂交，然后再以ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45第一植株为轮回亲本进行多代回交，将来自实施例2的T0代转pMs45-Lc玉米转变为含有Ms45-Lc杂合且ms45位点为纯合隐性的自交系，该自交系即为Ms45-Lc杂合且ms45纯合的第二植株，又名郑58Ms45-Lc杂合且ms45纯合隐性。具体方法如下：将实施例2中的T0代转pMs45-Lc玉米父本与一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45杂交，从杂交后代中挑选紫色籽粒播种到田间后喷施200mM的双丙胺磷，对存活的植株继续与郑58ms45ms45回交，如此回交5-6代后，由于回交过程中一直选择紫色籽粒或植株与第一植株杂交，紫色籽粒或植株含有转基因位点Ms45-Lc，因此得到的后代中紫色籽粒或植株转基因位点Ms45-Lc均为杂合。利用紫色籽粒或紫色植株的花粉给第一植株授粉，得到的正常籽粒黄色籽粒或正常植株绿色植株若均为不育，则提供花粉的植株转基因位点Ms45-lc为杂合且ms45位点为隐形纯合，即为第二植株。2、制备第二植株Ms45-Oy1杂合且ms45纯合将一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45第一植株，母本与实施例2得到的T0代转pMs45-Oy1玉米父本杂交，然后再以ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45第一植株为轮回亲本进行多代回交，将来自实施例2的T0代转pMs45-Oy1玉米转变为含有Ms45-Oy1杂合且ms45位点为纯合隐性的自交系，该自交系即为Ms45-Oy1杂合且ms45纯合的第二植株，又名郑58Ms45-Oy1杂合且ms45纯合隐性。具体方法如下：将实施例2中的T0代转pMs45-Oy1玉米父本与一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45杂交，从杂交后代中挑选黄色植株播种到田间后喷施200mM的双丙胺磷，对存活的植株继续与郑58ms45ms45回交，如此回交5-6代后，由于回交过程中一直选择黄色植株与第一植株杂交，黄色植株含有转基因位点Ms45-Oy1，因此得到的后代中黄色植株转基因位点Ms45-Oy1均为杂合。利用黄色植株的花粉给第一植株授粉，得到的正常植株绿色植株若均为不育，则提供花粉的植株转基因位点Ms45-Oy1为杂合且ms45位点为隐形纯合，即为第二植株。3、制备第二植株Ms45-Wi2杂合且ms45纯合将一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45第一植株，母本与实施例2得到的T0代转pMs45-Wi2玉米父本杂交，然后再以ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45第一植株为轮回亲本进行多代回交，将来自实施例2的T0代转pMs45-Wi2玉米转变为含有Ms45-Wi2杂合且ms45位点为纯合隐性的自交系，该自交系即为Ms45-Wi2杂合且ms45纯合的第二植株，又名郑58Ms45-Wi2杂合且ms45纯合隐性。具体方法如下：将实施例2中的T0代转pMs45-Wi2玉米父本与一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45杂交，从杂交后代中挑选萎蔫植株萎蔫程度如图8A所示，主要表现为心叶卷曲播种到田间后喷施200mM的双丙胺磷，对存活的植株继续与郑58ms45ms45回交，如此回交5-6代后，由于回交过程中一直选择萎蔫植株与第一植株杂交，萎蔫植株含有转基因位点Ms45-Wi2，因此得到的后代中萎蔫植株转基因位点Ms45-Wi2均为杂合。利用萎蔫植株的花粉给第一植株授粉，得到的正常植株绿色植株若均为不育，则提供花粉的植株转基因位点Ms45-Wi2为杂合且ms45位点为隐形纯合，即为第二植株。三保持系的获得将二得到郑58Ms45-Lc杂合且ms45纯合第二植株为父本，与一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45母本杂交，产生的后代不但有郑58ms45ms45，而且还有雄性不育郑58的保持系郑58Ms45-Lc杂合ms45ms45。并且郑58ms45ms45的籽粒正常，而其保持系郑58Ms45-Lc杂合ms45ms45籽粒为紫色图2中B所示籽粒。具体选育过程见附图6。将二得到郑58Ms45-Oy1杂合且ms45纯合第二植株为父本，与一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45母本杂交，产生的后代不但有郑58ms45ms45，而且还有雄性不育郑58的保持系郑58Ms45-Oy1杂合ms45ms45。并且郑58ms45ms45的植株正常绿色图7B所示，而其保持系郑58Ms45-Oy1杂合ms45ms45植株为黄色。将二得到郑58Ms45-Wi2杂合且ms45纯合第二植株为父本，与一得到的ms45纯合隐性自交系郑58郑58ms45ms45母本杂交，产生的后代不但有郑58ms45ms45，而且还有雄性不育郑58的保持系郑58Ms45-Wi2杂合ms45ms45。并且郑58ms45ms45植株正常图8B所示，而其保持系郑58Ms45-Wi2杂合ms45ms45籽植株为萎蔫状态。四、使用雄性不育保持系对ms45雄性不育自交系进行大规模扩繁以郑58自交系为例，将一得到的第一植株雄性不育系郑58ms45ms45和三得到的雄性不育保持系郑58Ms45-Lc杂合ms45ms45播种到田间，两个材料相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系与保持系田间自然授粉。保持系只能接受自己的花粉，产生的后代中由于含有纯合的转基因成分的籽粒与杂合的籽粒无法辨别，这些籽粒予以丢弃，而正常的籽粒可以作为不育系。不育系材料接受了保持系的花粉，其后代中正常籽粒的为不含转基因成分的不育系，而紫色籽粒或植株为含有转基因成分的保持系。保持系全部用于下一年扩繁不育系和保持系，而不育系中大部分用于生产商品种，剩余的小部分用于下一年扩繁不育系和保持系，具体生产流程如附图6所示。以郑58自交系为例，将一得到的第一植株雄性不育系郑58ms45ms45和三得到的雄性不育保持系郑58Ms45-Oy1杂合ms45ms45播种到田间，两个材料相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系与保持系田间自然授粉。保持系只能接受自己的花粉，产生的后代中由于含有纯合的转基因成分的籽粒与杂合的籽粒无法辨别，这些籽粒予以丢弃，而正常的籽粒可以作为不育系。不育系材料接受了保持系的花粉，其后代中正常籽粒的为不含转基因成分的不育系，而黄色植株为含有转基因成分的保持系。保持系全部用于下一年扩繁不育系和保持系，而不育系中大部分用于生产商品种，剩余的小部分用于下一年扩繁不育系和保持系。以郑58自交系为例，将一得到的第一植株雄性不育系郑58ms45ms45和三得到的雄性不育保持系郑58Ms45-Wi2杂合ms45ms45播种到田间，两个材料相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系与保持系田间自然授粉。保持系只能接受自己的花粉，产生的后代中由于含有纯合的转基因成分的籽粒与杂合的籽粒无法辨别，这些籽粒予以丢弃，而正常的籽粒可以作为不育系。不育系材料接受了保持系的花粉，其后代中正常植株的为不含转基因成分的不育系，而萎蔫植株为含有转基因成分的保持系。保持系全部用于下一年扩繁不育系和保持系，而不育系中大部分用于生产商品种，剩余的小部分用于下一年扩繁不育系和保持系。实施例4、利用实施例3中的雄性不育系大规模生产杂交种在实施例3中生产的不育系为细胞核控制的隐性纯合不育系，该不育系可以被任意的野生型植株Ms45Ms45恢复育性。因此只要选择一个与雄性不育ms45ms45自交系,如雄性不育郑58ms45ms45配合力高的自交系，如昌7-2进行杂交，便可以生产出农艺性状优良的杂交种。为了达到以上目的，将雄性不育自交系与野生型自交系隔行播种于田间，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，不育系的果穗只能接受野生型自交系的花粉，而野生型自交系只能自交。这样不育系果穗上所产生的种子为杂交种。序列表中国农业大学形态标记法扩繁植物核雄性不育系8PatentInversion3.513504DNAArtificialsequence1tgctgagttctccttgggttatccatggtgtctctatgaaaaagatgagtacaatgtgtc60tatatccgttttcttagggtcccttcttctgccttattactgactgaatcggggttacaa120aaaaacttccacgggtgcatgatctccatgttccacttctcccacctcgcgttgcacatt180tcttggatgtcggtggttcccatctgaccgaggcccatcagacacctttcgggacaccca240tcaagggcctttcggatggcccacgagacgtatcgggtcgtggtgatccaggggatatat300gtcccccacaatcgtcacctatattattattctttagatattatttaatttttggaaaaa360taacaaacttatacttttgtgtagggcctcagcatagattttcgcttagggcccagaaat420gcgaggaccagccatgtctagtgtccactattggcactacccagaacaagatttaaaaaa480a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权利要求：1.一种方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括：a提供第一植株，其包含使植物雄性不育的纯合隐性等位基因；b提供第二植株，该植株包含同所述第一植株相同使植物雄性不育的纯合隐性等位基因，并且含有下述构建体，所述构建体在所述第二植株中以杂合状态存在，所述构建体包含：i.第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时将恢复所述第一植株雄性生育力；ii.第二核苷酸序列，当其以杂合状态存在时即可影响植株形态，通过肉眼或仪器可以分辨含有该构建体的植株或籽粒和不含有该构建体的植株或籽粒；所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列紧密相连，这两个核苷酸序列在植株中同时存在；c用所述第二植株的雄性配子与所述第一植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为扩繁植物雄性不育系的方法；或，所述影响植株形态为改变植株颜色或改变籽粒颜色或改变植株萎蔫程度；或，所述植物、所述第一植株和所述第二植株均为双子叶植物或者单子叶植物。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述第一植株为玉米雄性不育突变体ms45；和或，所述第一核苷酸序列包括控制雄性生育能力的基因。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述控制雄性生育能力的基因为Ms45基因表达元件，所述Ms45基因表达元件在所述第一植株中表达蛋白质Ms45；所述蛋白质Ms45为如下a或b：a序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列3具有相同功能的蛋白质。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株颜色或籽粒颜色或植株萎蔫程度；所述第二核苷酸序列包括控制植株颜色或籽粒颜色或植株萎蔫程度的基因。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述控制植株颜色或籽粒颜色的基因为花青素合成的关键基因Lc或叶绿素合成基因Oy1；或，所述控制植株萎蔫程度的基因为Wi2基因；或，所述基因Lc在所述第二植株中表达蛋白质LC；或，所述基因Oy1在所述第二植株中表达蛋白质Oy1；或，所述基因Wi2在所述第二植株中表达蛋白质Wi2；或，所述蛋白质LC为如下a或b：a序列4所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列3具有相同功能的蛋白质；或，所述蛋白质Oy1为如下a或b：a序列7所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列7具有相同功能的蛋白质；或，所述蛋白质Wi2为如下a或b：a序列8所示的氨基酸残基组成的蛋白；b经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与序列8具有相同功能的蛋白质。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的籽粒或植株是否紫色；或所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株是否黄色；或所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时影响所述第二植株的植株是否萎蔫。8.一种DNA构建物，该构建物如权利要求1中所述的构建体。9.如下任一种的物质：1一种植物，该植物如权利要求1所述的第二植株；2由1所述的植物产生的再生细胞的组织培养物；3由2所述的组织培养物产生的原生质体；4一种植物，所述植物是利用权利要求1所述方法产生的纯合隐性的雄性不育植株。10.利用权利要求1所述方法产生的纯合隐性雄性不育植株在生产杂交种中的用途。

百度查询： 中国农业大学 形态标记法扩繁植物核雄性不育系

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