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申请/专利权人：盐城工学院
摘要：本发明公开了一种TRV病毒诱导棉花PR5基因沉默的方法和应用，利用TRV诱导基因沉默的方法进行实验，将PR5基因克隆到表达TRVRNA2的质粒pTRV2上，再和表达TRVRNA1质粒pTRV1进行共注射，共注射携带pTRV1及pTRV2::PR5质粒的农杆菌到棉花子叶上，2周后取新长出的顶叶及根材料提取RNA，qRT‑PCR检测PR5的表达情况。本发明使用一种更加直接、高效的棉花根部接种方法，降低了棉花靶标基因PR5的本底表达水平，同时对预防棉花黄萎病这类土传病害更为有效。
主权项：1.一种TRV病毒诱导棉花PR5基因沉默的方法在抗棉花黄萎病中的应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1将棉花PR5基因的cDNA连接到表达TRVRNA2的质粒pTRV2病毒载体上，制备重组载体，转化大肠杆菌感受态细胞，提取测序正确的质粒pTRV2::PR5备用；其中，所述棉花PR5基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；步骤2将步骤1所述构建好的质粒pTRV2::PR5和表达TRVRNA1的质粒pTRV1分别转化农杆菌，涂布含有卡那霉素和利福平的LB平板培养基，28℃暗培养2d，挑取单菌落鉴定后保种；步骤3将步骤2所述农杆菌分别转入100mL液体LB培养基中振荡培养，加入卡那霉素、利福平、MES和AS；步骤44000rpm离心10min收集步骤3所述农杆菌的细胞，用10mMMgCl2调OD600＝0.6，加入终浓度200μM的AS，把pTRV2::PR5和pTRV1转化的两种农杆菌等体积混合，放置暗处3～6h，制备农杆菌菌液备用；步骤5准备生长9天的棉花苗，分别进行以下操作：步骤5-1用针头在棉花子叶左右两边各扎一个非通透的小孔，用1mL注射器将步骤4所述农杆菌菌液均匀地注射到叶片中，放水中暗培养1d，温度控制在22～25℃范围内；步骤5-2把棉花下胚轴以下部分浸泡在步骤4所述农杆菌菌液里，真空抽3次，放水中暗培养1d，温度控制在22～25℃范围内；步骤6两周后取步骤5-1的棉花顶叶材料、步骤5-2的棉花根部材料做qRT-PCR，检测棉花基因是否沉默。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 盐城工学院 一种TRV病毒诱导棉花PR5基因沉默的方法和应用
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