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申请/专利权人：西南大学

摘要：本发明提供了一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其通过GAL4UAS系统，分别构建了若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体和多个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，通过将表达Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游，最终构建成UAS表达载体，进而利用GAL4UAS遗传操作工具达到家蚕基因的可控编辑。本发明根据家蚕基因组序列数据库中家蚕基因的序列密码子偏好性，对Cas9蛋白的基因序列进行了优化设计，使Cas9基因更有利于在家蚕丝腺中高效表达。本发明利用该可控的基因编辑技术可精准研究家蚕丝腺基因的功能和创制更多的生物遗传资源。

主权项：1.一种针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法，其特征在于，其通过GAL4UAS系统，构建了若干个分别在家蚕MSG和PSG中特异启动表达的GAL4表达载体，通过将密码子优化的Cas9基因序列与U6驱动表达的gRNA靶点一起串联在UAS序列下游，最终构建成UAS表达载体，进而利用GAL4UAS遗传操作工具达到家蚕基因的可控编辑；所述若干个在家蚕MSG中特异启动表达的GAL4表达载体为4个在家蚕MSG中特异启动表达；所述若干个在家蚕PSG中特异启动表达的GAL4表达载体为3个在家蚕PSG中特异启动表达；所述可控编辑方法利用GAL4UAS双元表达系统和CRISPRCas9的基因编辑系统，用于产生一种能在家蚕中部丝腺和后部丝腺中进行组织特异性敲除的转基因表达载体；所述的针对家蚕MSG和PSG表达基因的可控编辑方法包括以下步骤：步骤S1，家蚕MSG特异GAL4表达载体的构建：分别构建了4种家蚕中部丝腺特异表达载体，所述表达载体的目的基因表达框包括选自以下4种家蚕中部丝腺特异的启动子中的一种：家蚕Ser1基因启动子，其序列为SEQIDNO.1、家蚕Ser2基因启动子，其序列为SEQIDNO.2、家蚕Ser3基因启动子，其序列为SEQIDNO.3、家蚕Ser4基因启动子，其序列为SEQIDNO.4；所述表达载体的目的基因表达框的目的基因为编码GAL4蛋白结合结构域的基因序列GAL4BD，其基因序列为SEQIDNO.5、VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列，其基因序列为SEQIDNO.6、Ser1-polyA为终止信号，其序列为SEQIDNO.7；将目的基因表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列，其序列为SEQIDNO.8，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了红色荧光蛋白DsRed序列组成；随后在3×P3-DsRed序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂，其序列为SEQIDNO.9和piggyBac左臂，其序列为SEQIDNO.10；步骤S2，针对家蚕MSG的UAS敲除表达载体的构建：构建了一种以UAS串联Cas9蛋白及BmYki靶点的转基因表达载体；所述载体的目的基因表达框包括：与GAL4蛋白特异结合的10×UAS上游序列，其序列为SEQIDNO.12、根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas9基因序列，其基因序列为SEQIDNO.13、驱动表达BmYki靶点序列的U6启动子，其序列为SEQIDNO.14、2个BmYki靶点序列，其序列分别为ggactcaaagcgaccgctacagg和gatcttggacccttaccagcagg、Ser1-polyA为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列，其序列为SEQIDNO.15，该序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了蓝色荧光蛋白ECFP序列组成；随后在3×P3-ECFP序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂和piggyBac左臂；步骤S3，家蚕PSG特异GAL4表达载体的构建：分别构建了3种家蚕后部丝腺特异表达载体，所述表达载体的目的基因表达框包括选自以下3种家蚕后部丝腺特异的启动子中的一种：家蚕fibH基因启动子，其序列为SEQIDNO.16、家蚕fibL基因启动子，其序列为SEQIDNO.17、家蚕P25基因启动子，其序列为SEQIDNO.18；所述表达载体的目的基因表达框的目的基因为GAL4BD、VP16为激活基因表达的蛋白结构域序列、Ser1-polyA为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-DsRed]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-DsRed序列，该3×P3-DsRed序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了红色荧光蛋白DsRed序列组成；随后在3×P3-DsRed序列的5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂和piggyBac左臂；步骤S4，针对家蚕PSG的UAS敲除表达载体的构建：构建了一种以UAS串联Cas9蛋白及BmHR3靶点的转基因表达载体；所述载体的目的基因表达框包括10×UAS上游序列、根据家蚕密码子偏好进行优化的编码Cas9蛋白序列、U6启动子、2个BmHR3靶点序列，其序列分别为atgcggagataaatcgtcggggg和ccgatgccagtactgcagactac、Ser1-polyA为终止信号；将目的表达框插入到piggyBac载体骨架上即pBac[3×P3-ECFP]，该载体骨架由以下步骤完成：首先组装3×P3-ECFP序列，该序列是由3倍重复的P3眼睛和神经特异的启动子驱动表达了青色荧光蛋白ECFP组成；随后在3×P3-ECFP序列5’端和3’端分别组装上piggyBac右臂和piggyBac左臂；步骤S5，转基因家蚕的制作：通过将表达载体分别通过家蚕胚胎显微注射，获得眼睛发红色荧光的GAL4转基因家蚕和眼睛发青色荧光的UAS转基因家蚕，将两种转基因家蚕进行两两杂交，获得眼睛即发红色荧光也发青色荧光的MSG特异性敲除的转基因家蚕和PSG特异性敲除的转基因家蚕；步骤S6，形态学观察及分子检测：分别观察中部丝腺和后部丝腺的形态，并对中部丝腺和后部丝腺进行分子检测发现靶点已进行特异性敲除。

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