申请/专利权人：四川农业大学;成都大熊猫繁育研究基地

申请日：2021-12-28

公开（公告）日：2024-04-26

公开（公告）号：CN115057915B

主分类号：C07K14/325

分类号：C07K14/325;C07K1/22;C12N15/32;C12N15/70;C12N15/66;A61K38/16;A61P33/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.26#授权;2022.10.04#实质审查的生效;2022.09.16#公开

摘要：本申请实施例公开了一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，用于测定大肠杆菌异源表达重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫的杀灭活性。本申请实施例方法包括：运用在线工具GENSCAN获取BtCry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamHI和HindIII酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列；合成嵌合序列得到合成序列；将合成序列插入pMD19‑T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到的克隆质粒用双酶切后连入pET‑32a+原核表达载体，得到pET‑32a‑Cry5B重组质粒；将pET‑32a‑Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3进行表达，得到重组Cry5B蛋白；重组Cry5B蛋白亲和层析后，得到纯化的重组Cry5B蛋白；将纯化的重组Cry5B蛋白进行倍比稀释，评价不同浓度重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性。

主权项：1.一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用，其特征在于，所述蛋白Cry5B的制备方法包括：S1、运用在线工具GENSCAN获取BtCry5B基因完整开放阅读框序列，分别在序列5’和3’端加入BamHI和HindIII酶切位点及其保护性碱基，得到嵌合序列；S2、合成步骤S1中的所述嵌合序列以得到合成序列，将所述合成序列插入pMD19-T克隆质粒进行TA克隆和测序分析，得到克隆质粒；S3、提取步骤S2中的所述克隆质粒，用双酶切后连入pET-32a+原核表达载体，得到pET-32a-Cry5B重组质粒；S4、将步骤S3中的所述pET-32a-Cry5B重组质粒转入原核表达菌DE3后进行诱导表达，得到重组Cry5B蛋白；S5、将步骤S4中的重组Cry5B蛋白进行亲和层析，得到纯化的重组Cry5B蛋白；S6、将步骤S5中纯化的重组Cry5B进行倍比稀释，评价不同浓度纯化的重组Cry5B蛋白对大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫的杀灭活性；所述重组Cry5B蛋白基因完整ORF长度为3738bp，编码1246个氨基酸，分子量MW为139.889kD，理论等电点pI为5.18；重组Cry5B蛋白不含信号肽和跨膜区；所述重组Cry5B蛋白包含Endotoxin_N结构域、δ-Endotoxin_C结构域、Endotoxin_C结构域、Endotoxin_C2结构域、Cry1Ac_D5结构域；对于大熊猫蛔虫L4期幼虫，所述重组Cry5B蛋白的半数致死有效剂量ED50值第3天为14.5μgmL，95％置信区间0.57-1.23；ED50值第5天为1.3μgmL，95％置信区间0.05-0.78；ED50值第7天为0.16μgmL，95％置信区间0.05-0.78；对于大熊猫蛔虫成虫，所述重组Cry5B蛋白杀灭大熊猫蛔虫成虫的使用浓度为10μgmL-100μgmL。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 四川农业大学;成都大熊猫繁育研究基地 一种大肠杆菌表达蛋白Cry5B在制备抗大熊猫蛔虫成虫和L4期幼虫活性药物中的应用

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