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申请/专利权人：黑龙江省科学院高技术研究院
申请日：2024-03-07
公开（公告）日：2024-06-04
公开（公告）号：CN118126985A
主分类号：C12N9/16
分类号：C12N9/16;C12N15/70;C12Q1/44
优先权：
专利状态码：在审-实质审查的生效
法律状态：2024.06.21#实质审查的生效;2024.06.04#公开
摘要：一种小黑杨磷脂酶C的原核表达、纯化和体外活性分析方法，本发明的目的是为了解决目前小黑杨磷脂酶C功能研究方法成本高，过程繁琐，尤其是对于可溶性表达和纯化及磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C无法实现低成本快速活性分析的问题。本发明通过构建pEGX‑GST‑PLC载体并转化BL21，IPTG诱导后，超声裂解菌体，离心后收集上清与GSTResin孵育，对目的蛋白进行纯化，随后用还原型谷胱甘肽洗脱液洗脱GST‑PLC融合蛋白。回收融合蛋白对肌醇磷脂类底物进行水解催化，通过孔雀石绿法测定反应液无机磷浓度，证明融合蛋白具备磷脂酶C活性。
主权项：1.一种小黑杨磷脂酶C的原核表达、纯化和体外活性分析方法，其特征在于所述的方法是按照以下步骤进行的：1小黑杨磷脂酶C原核表达菌株构建将PsnPLC序列插入到pGEX-KG载体，经验证插入成功后，提取重组质粒，转入感受态细胞中，构建得到原核表达菌株，冻存；2小黑杨磷脂酶C原核表达将步骤1冻存的原核表达菌株接种于培养基中，诱导表达后，经离心，收集菌体，冻存备用；3小黑杨磷脂酶C纯化将步骤2冻存菌体重悬于预冷PBS，加入溶菌酶冰上孵育后，补加PBS至预设总体积，加入曲拉通，冰上孵育，超声破碎，离心，上清转移至新管冻存；将上清与GSTresin进行混合，冰浴后，回收孵育体系，离心，去上清，加入PBS重悬，离心去上清，加入PBS重悬，离心后，吸出上清，反复洗珠子，最后加入等体积PBS重悬，加入洗脱液，冰浴后，得到纯化的小黑杨磷脂酶C；4小黑杨磷脂酶C体外活性分析水解小黑杨磷脂酶C，对水解产物抽提并进行无机磷浓度测定。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 黑龙江省科学院高技术研究院 一种小黑杨磷脂酶C的原核表达、纯化和体外活性分析方法
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