申请/专利权人：南京工业大学

申请日：2021-07-28

公开（公告）日：2024-06-04

公开（公告）号：CN113567667B

主分类号：G01N33/569

分类号：G01N33/569;G01N33/558;G01N21/64

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.04#授权;2021.11.16#实质审查的生效;2021.10.29#公开

摘要：本发明公开了一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用，所述试纸条包括硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜两端分别设有样品垫和吸水垫，所述样品垫、吸水垫和硝酸纤维素膜均置于底板上，其特征在于，所述硝酸纤维素膜设有检测线和控制线，所述检测线含有恙虫病东方体混合重组抗原，所述质控线含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体。本发明采用双抗原夹心法实现对恙虫病东方体抗体的检测，具有检测仪器成本低，操作简单，快速，稳定性好，特异型好，灵敏度高，实用性较强、容易保存、具有市场开发价值。

主权项：1.一种检测恙虫病东方体抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光免疫层析试纸条，所述荧光免疫层析试纸条包括硝酸纤维素膜（4），所述硝酸纤维素膜（4）两端分别设有样品垫（2）和吸水垫（7），所述样品垫（2）、吸水垫（7）和硝酸纤维素膜（4）均置于底板（3）上，所述硝酸纤维素膜（4）设有检测线（5）和质控线（6），所述检测线（5）含有恙虫病东方体混合重组抗原，所述质控线（6）含有兔抗恙虫病东方体多克隆抗体；所述恙虫病东方体混合重组抗原是以从恙虫病东方体SJ2菌株感染的L929细胞培养液中提取的基因组为模板，扩增目的基因；将所得目的基因连接表达载体pET-28（+），经转化、表达，所得SJ2重组抗原与Ptan株重组抗原和Gilliam株重组抗原按照1：1：1体积比混合获得；其中，所述扩增目的基因的上下引物和下游引物分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示；所述试剂盒还包括荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原，所述荧光微球偶联的恙虫病东方体混合重组抗原的制备方法为：（1）每10µL固含量1%的荧光微球中加入0.1molL2-吗啉乙磺酸缓冲MES溶液1mL，振荡混匀5min；4℃，12000rpm离心20min，弃上清，再次使用1mL0.1molL的2-吗啉乙磺酸MES缓冲液溶解荧光微球，得到混悬液；（2）在步骤（1）所得混悬液中加入20µL新鲜配制的1-3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液，EDC和NHS均为1mgmL，溶剂为超纯水，涡旋混匀后，4℃振荡活化1h，再于12000rpm，4℃，离心20min，弃上清，使用1mLMES缓冲液清洗荧光微球1次，去除残留的EDC和NHS，得到沉淀；（3）将步骤（2）所得沉淀利用1mLMES缓冲液重悬，加入30µL步骤（1）所制备的恙虫病东方体混合重组抗原0.3mgmL，旋涡混匀，4℃振荡偶联2h，得到混悬液；（4）在步骤（3）所得混悬液中加入250µL10%BSA溶液，使其终浓度为2%，4℃振荡封闭1h，再于12000rmin，4℃，离心20min；沉淀用1mL荧光微球保护液pH6.5复溶，超声30-60s，使荧光微球被完全吹散，4℃保存备用。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 南京工业大学 一种检测恙虫病东方体抗体的荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

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