申请/专利权人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)

申请日：2024-03-04

公开（公告）日：2024-06-14

公开（公告）号：CN118185985A

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C07K14/45;A01H5/12;A01H6/82;G01N33/569;G01N33/68

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.07.02#实质审查的生效;2024.06.14#公开

摘要：本发明公开了一种利用烟草表达弓形虫TgGRA3蛋白的方法及其在诊断猫弓形虫感染中的应用。本发明首先利用大肠杆菌表达了多种具有潜在抗原性的弓形虫致密颗粒蛋白，包括TgGRA2、TgGRA3、TgGRA4、TgGRA5、TgGRA6、TgGRA7和TgGRA8，但只有TgGRA6和TgGRA7成功表达。然而实验数据表明TgGRA7和TgGRA6对于检测猫弓形虫感染都不够敏感。因此，本发明发明人尝试在烟草中表达TgGRA3，结果TgGRA3重组蛋白在烟草中成功表达。然后本发明选取7份真阳性样品检测重组TgGRA3的抗原性。结果表明，TgGRA3能与这些样品中的抗体发生强烈反应。重要的是，与TgGRA6‑或TgGRA7‑ELISA相比，TgGRA3‑ELISA能够更加灵敏的区分阳性猫样本和阴性对照，这表明TgGRA3在诊断猫弓形虫感染方面具有良好的潜力。

主权项：1.一种利用烟草表达弓形虫TgGRA3蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1载体构建根据TOXODB中TGGT1_227280GRA3序列，从弓形虫RH速殖子扩增GRA3基因开放阅读框全长，扩增引物如下:GRA3-ForwardPrimer:5’-ATGGCTGATCAACCTGAAAA-3’，GRA3-ReversePrimer:5’-GTTGTTGTTATTGTTATTAG-3’，并将纯化好的PCR反应产物通过PacⅠ和NotⅠ酶切位点连接至pJL-TRBO载体，转化大肠杆菌感受态细胞；吸取感受态细胞加到含50μgmLKan+的LB培养平板上，将细胞均匀涂开，将平板置于37℃恒温箱倒置过夜培养，将测序正确的阳性单克隆提取重组质粒，命名为pJL-TRBO-GRA3-6×His，并将其转化农杆菌感受态，然后加入无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3小时后5000rpm离心一分钟收菌，留取80-150μL上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含50μgmLKan+和100μgmLrif+的YEP平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天；2烟草瞬时转化挑取测序正确的pJL-TRBO-GRA3-6×His阳性单克隆菌株至含相应抗生素的YEP培养基中，在28℃摇床上200rpm孵育过夜至OD600≈1.2，在室温下5000rpm离心10min收集微生物，在含有10mMMES,10mMMgCl2和150μMAS的渗透培养基中重悬至OD600≈0.3-0.5，避光培养3-6小时；将生长旺盛期的水培本烟叶片浸泡在农杆菌悬浮液中，并施加约0.4Mpa的真空30-45秒后取出用水冲洗，将浸染后的植株放在与渗透前相同的生长条件下生长，30-40h后收集表达重组蛋白的烟叶；3蛋白提取以及纯化将表达重组蛋白的烟叶称取重量后液氮速冻，并在提前预冷的研钵中用液氮快速研磨，直到叶片材料被磨成非常细的粉末，然后将粉末转移至离心管，用2倍体积的提取液充分振荡后，在4℃下孵育30min，期间可在摇床上4℃旋转，样品在4℃下以12,000rpm离心20分钟，收集上清液，根据上清液的体积加入1mMPMSF，混合均匀备用；采用真空过滤装置过滤上清液，去除不溶性物质，得到粗提蛋白TgGRA3；4纯化将获得的粗提蛋白TgGRA3装在Ni-NTA预装柱上用蛋白纯化仪纯化，在280nm处监测吸光度，收集蛋白峰对应的蛋白，最后将纯化的TgGRA3蛋白用His抗体免疫沉淀，并通过westernblotting检测。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心) 一种利用烟草表达弓形虫TgGRA3蛋白的方法及其在诊断猫弓形虫感染中的应用

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