申请/专利权人：南京农业大学

申请日：2022-09-05

公开（公告）日：2024-06-14

公开（公告）号：CN115615785B

主分类号：G01N1/30

分类号：G01N1/30;G01N1/28

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.06.14#授权;2023.02.10#实质审查的生效;2023.01.17#公开

摘要：本发明公开了一种利用预换液技术提高梨花粉管细胞壁甲酯化果胶染色效果的方法，该方法包括采集花粉、花粉的体外培养、使用预换液技术对花粉进行固定和封闭、抗体孵育、观察及测定等步骤。该方法不涉及传统的染料与多糖共价结合的技术，而是使用预换液技术及抗体——抗原特异结合的原理对梨花粉管细胞壁甲酯化果胶进行染色，具有安全高效、特异性强、破损率低、易于观察等优点。该方法对梨花粉管的甲酯化果胶的检测，有助于梨花粉生活力的测定以及对花粉管生长代谢等生殖生理过程的研究，同时也为其他植物组织或花粉管甲酯化果胶染色提供方法参考。

主权项：1.一种利用预换液技术提高梨花粉管细胞壁甲酯化果胶染色效果的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）花粉采集：采集大蕾期梨花药并干燥；（2）花粉培养：分离花药中的花粉，将分离的花粉加入花粉培养基中避光培养；（3）花粉管的收集及预换液：离心收集花粉管，去除花粉培养基，使用缓冲液对收集的花粉管进行预换液处理；（4）固定花粉管：向步骤（3）中最终收集的花粉管中加入细胞固定液，轻柔重悬，于22-25℃固定25-30min；（5）花粉管的收集及预换液：离心收集花粉管，去除细胞固定液，使用缓冲液对收集的花粉管进行预换液处理；（6）封闭：向步骤（5）中最终收集的花粉管中加入封闭液，轻柔重悬，于22-25℃封闭25-30min；所述的封闭液为1%wv的BSA溶液；（7）花粉管的收集及洗涤：离心收集花粉管，去除封闭液，使用0.1%wv的BSA溶液轻柔重悬花粉管，洗涤后离心弃废液，重复2-3次，收集花粉管；（8）孵育一抗：向步骤（7）中最终收集的花粉管中加入0.1%wv的BSA溶液稀释后的一抗，轻柔混匀，于4-8℃静置孵育6-8h；（9）花粉管的收集及洗涤：离心收集花粉管，去除孵育液，使用0.1%wv的BSA溶液轻柔重悬花粉管，洗涤后离心弃废液，重复2-3次，收集花粉管；（10）孵育二抗：向步骤（9）中最终收集的花粉管中加入用0.1%wv的BSA溶液稀释后的二抗，于22-25℃避光孵育35-45min；将孵育完毕的花粉管用0.1%wv的BSA溶液轻柔重悬，洗涤后离心弃废液，重复1-2次，收集花粉管，完成对梨花粉管细胞壁甲酯化果胶的染色；步骤（3）和（5）中对收集的花粉管进行预换液处理的步骤各自独立的为：用缓冲液轻柔重悬所收集的花粉管，洗涤3-5min，2000-3000rpm离心2-3min，弃废液，收集花粉管，重复2-3次；步骤（7）、（9）和（10）中所述洗涤后离心弃废液的过程各自独立的为：洗涤3-5min，2000-3000rpm离心2-3min，弃废液；所述缓冲液的配方为：135mMNaCl，3.2mMNa2HPO4，1.3mMKCl，0.5mMKH2PO4，10%wvPEG，pH7.0-7.5。

全文数据：

权利要求：

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