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申请/专利权人：青海大学
申请日：2021-09-27
公开（公告）日：2024-06-14
公开（公告）号：CN114112871B
主分类号：G01N15/14
分类号：G01N15/14
优先权：
专利状态码：有效-授权
法律状态：2024.06.14#授权;2022.03.18#实质审查的生效;2022.03.01#公开
摘要：本发明公开了一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，包括样品采集、杂质祛除、二次离心、酶解游离核酸、染色、镜检以及计数等步骤。本发明祛除盐湖样本中杂质，使得水系中浮游病毒易观察。
主权项：1.一种盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤S100：样品采集，使用无菌收集瓶浸入盐湖水面以下取出水样，立即加入戊二醛并置于4℃环境中避光固定保存；步骤S200：杂质祛除，在4℃环境中，用高速离心机离心处理步骤S100保存的样品，弃沉淀，取上清液，其中高速离心机转速为4000rmin，离心时间为5～10min；步骤S300：二次离心，在4℃环境中，用高速离心机继续离心处理步骤S200所得上清液5～10min，弃沉淀，继续取上清液，然后用滤膜过滤得最终上清液，其中高速离心机转速为6000rmin；步骤S400：酶解游离核酸，取步骤S300所得上清液，放入无菌离心管，加入RNaseA和DNaseI，静置20～30min；之后使用滤膜过滤，得过滤液；步骤S500：染色，取步骤S400中的过滤液加入1xSYBRGreenI，避光染色10～15min；再使用滤膜过滤，然后滤膜过滤抗腿色剂；步骤S600：镜检，将步骤S500得到的滤膜放置载玻片上，根据荧光强度、颗粒大小区分细菌与病毒，随机挑选若干视野进行计数；步骤S100中盐湖水样与戊二醛的体积比为9：1；还包括步骤S700：计数，计数结果取平均值后根据稀释倍数、视野面积、过滤面积计算浮游病毒的丰度；计算公式如下: 其中，A为浮游病毒的丰度，单位为个mL，n为单个视野下浮游病毒的平均数量，单位为个，Sm为滤膜面积，单位为mm2，Sf为显微视野面积，单位为mm2，d为计数样品稀释倍数；步骤S600具体为将步骤S500得到的滤膜放置载玻片上，在10×100倍的油镜下利用494nm蓝色激发光观察；根据荧光强度、颗粒大小区分细菌与病毒，随机挑选5个视野进行计数。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 青海大学 盐湖浮游病毒快速荧光显微计数方法
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