申请/专利权人：青岛农业大学

申请日：2024-04-08

公开（公告）日：2024-06-18

公开（公告）号：CN118207225A

主分类号：C12N15/29

分类号：C12N15/29;C07K14/415;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/74

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.06.18#公开

摘要：本发明提供MdDWARF14基因在增强苹果植株耐低温胁迫能力中的应用方法，涉及植物基因工程技术领域。该MdDWARF14基因在增强苹果植株耐低温胁迫能力中的应用方法，包括以下过程：步骤S1.MdDWARF14基因的单克隆扩增；步骤S2.构建植物超表达载体MdDWARF14‑pBI121；步骤S3.利用农杆菌介导法将植物超表达载体MdDWARF14‑pBI121转入GALA‑3植株；步骤S4.超表达MdDWARF14转基因植株功能验证。本发明中，以转基因植株的形式呈现，将MdDWARF14在苹果植株中过表达，调控苹果植株的生长发育进程，解决苹果耐低温资源匮乏的问题，增强苹果耐低温胁迫的能力，从而提高果树产量与品质，还可以显著增强苹果植株的耐低温胁迫能力，无需经过长时间年限来培育果树新品种，短时间内提高植物的产量与品质。

主权项：1.MdDWARF14基因在增强苹果植株耐低温胁迫能力中的应用方法，其特征在于，包括以下过程：步骤S1.MdDWARF14基因的单克隆扩增1PCR扩增MdDWARF14基因以上游引物F和下游引物R为引物对，用如下表1中的40微升体系对MdDWARF14基因进行单克隆扩增，得到MdDWARF14核苷酸双链；表1 组分 添加量μL LAtaq酶 0.4 上游引物F 2 下游引物R 2 dNTP 2 10×LAPCRBuffer 4 模板cDNA 4 H2O 25.6 Total 40 2将上述PCR扩增得到的MdDWARF14核苷酸双链用如下表2所示的10微升体系进行连接PMD-19-TSimple载体，在16℃下过夜连接，得到连接产物；表2 3连接产物转化感受态细胞将从-80℃超低温冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上融化，吸取20微升的DH5α感受态细胞于1.5mL无菌的离心管中，加入10微升连接产物，吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入2002L的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，摇菌结束后，取1002L菌液涂LB板，带有抗生素，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10-12h，待长出菌斑；4挑斑在无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养基，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个上述菌斑，形状比较规则的，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4-6h，得到菌液；5菌液鉴定摇菌结束后用表3所示的体系进行菌液鉴定，以上述菌液为模板，选用的上游引物为载体上游引物，选用的下游引物为基因的下游引物，按照正常验证流程进行鉴定，以水为阴性对照，检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液；表3 步骤S2.构建植物超表达载体MdDWARF14-pBI1211将阳性的菌液提质粒，质粒提取方法根据试剂盒步骤进行，得到连有MdDWARF14的PMD-19-TSimple融合质粒；2将连有MdDWARF14的PMD-19-TSimple融合质粒和pBI121空载体按照如表4所示的40微升体系进行双酶切，快切酶37℃反应30min；表4 组分 添加量微升 10×buffer 4 根据两种限制性内切酶活性共加入 4 质粒PBI121空载体 20 H2O 12 Total 40 3目的基因与目的载体的回收和连接：将上述切取目的基因的条带进行胶回收，同时将目的载体的酶切条带也切下进行胶回收，然后按照表5所示的体系进行连接；表5 组分 添加量微升 T4连接酶 1 10xT4buffer 1 目的基因和目的载体 8 Total 10 4将表6所示的体系将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；表6 组分 添加量微升 感受态细胞大肠杆菌DH5α 20 连接产物 10 Total 30 然后，将大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，立马放到事先准备好的冰上融化，吸取202L的大肠杆菌DH5α感受态细胞于一个的1.5mL的无菌离心管中，吸取构建好的连接产物102L，吹打混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入2002L的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，取1002L菌液涂LB板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10-12h；5挑斑：无菌超净台中，用无菌的枪头吸取1002LLB液体培养基，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个菌斑，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4-6h；6菌液鉴定：摇菌结束后用上表3所示的102L体系进行PCR鉴定，以菌液为模板，引物为载体的上游引物，基因的下游引物，按照正常的验证流程进行鉴定，以水为阴性对照，检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液；7将阳性的菌液提质粒，质粒提取方法根据试剂盒步骤进行，得到植物超表达载体MdDWARF14-pBI121；步骤S3.利用农杆菌介导法将植物超表达载体MdDWARF14-pBI121转入GALA-3植株1将植物超表达载体MdDWARF14-pBI121转化到农杆菌EHA105中：从-80℃超低温冰箱中取出农杆菌EHA105感受态细胞，吸取50微升的农杆菌EHA105感受态细胞于一个1.5mL的无菌离心管中，加入超表达载体MdDWARF14-pBI1215微升，吹打混匀，冰浴5min，液氮飘5min，37℃热激5min，再冰浴5min，在超净工作台中将其加入1毫升的YEP液体培养基中，置于28℃、转速为180rpm的摇床中摇菌4-6h，在摇菌结束后，6000rmp离心5min，弃上清800微升，吹打混匀，取200微升菌液涂YEP板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到28℃恒温培养箱中培养24-48h；2农杆菌介导法将表达载体转入GALA-3植株：GALA-3植株从继代培养约30天的组培苗上剪取叶片用于遗传转化，选择组培苗顶部3-4片叶展开的幼嫩叶片，剪去叶尖和叶柄部分，将中间部位划2道伤痕，立即置于预培养基中进行预培养，无光，24℃，2天，将获得的农杆菌EHA105用YEP培养基培养皿中在摇床中以180rpm，28℃振荡培养50mL，培养4-6小时，直至OD值为0.4-0.6，用离心机以25℃，5000rpm离心5min收集菌体，用葡萄糖液体培养基将菌液悬浮起来，加入20mg乙酰丁香酮备用；然后，将预培养的叶片置于有农杆菌的液体共培养基中，晃动，每隔2min晃动几次，浸染时间大概8min左右，然后将叶块转移到无菌滤纸上吸干菌液，将表面没有菌液的叶块迅速转移至分装有共培养基的培养皿，待叶片长出转基因小芽，将小芽用扩繁培养基扩增起来，待小芽长成小苗后，放入生根培养基中生根，得到转基因植株。

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