申请/专利权人：福建农林大学

申请日：2024-03-22

公开（公告）日：2024-06-28

公开（公告）号：CN118256545A

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C12N15/66;C12N15/113;C12N1/21;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46;C12R1/01

优先权：

专利状态码：在审-公开

法律状态：2024.06.28#公开

摘要：本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于增强水稻对RRSV和RGSV病毒抗性的二价RNAi双T‑DNA载体及方法。本发明采用转基因技术，首先根据RRSV基因组第10条dsRNA的183‑444bp和RGSV基因组第5条vcRNA的1909‑2179bp构建二价RNAi双T‑DNA载体，进而利用农杆菌介导转化水稻愈伤组织，通过分子检测获取无标记转基因水稻纯合系，抗病性鉴定结果显示：与野生型相比，无标记转基因水稻纯合系对RRSV和RGSV病毒的抗性明显提高。

主权项：1.一种用于增强水稻对水稻锯齿叶矮缩病毒和水稻草状矮化病毒抗性的二价RNAi双T-DNA载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1）以水稻锯齿叶矮缩病毒cDNA为模板，以引物iRRSV-XhoI-f262和iRRSV-rgsv-r262进行PCR扩增，获得PCR产物1；以水稻草状矮化病毒cDNA为模板，以引物iRGSV-BglII-f271和iRGSV-rrsv-r271进行PCR扩增，获得PCR产物2；将PCR产物1和PCR产物2混合，以引物iRRSV-XhoI-f262和iRGSV-BglII-f271进行重叠PCR扩增，获得病毒融合片段；2）用XhoI和BglII双酶切包含Intron的中间载体pUCCRNAi和病毒融合片段，用T4DNA连接酶将酶切后的pUCC中间载体和病毒融合片段连接，获得pUCC-RRSVRGSV-intron载体；用SalI和BamHI双酶切pUCC-RRSVRGSV-intron载体，用XhoI和BglII双酶切病毒融合片段，用T4DNA连接酶将酶切后的pUCC-RRSVRGSV-intron载体和病毒融合片段连接，获得pUCC-RRSVRGSV-intron-RGSVRRSV载体；3）用PstI单酶切pUCC-RRSVRGSV-intron-RGSVRRSV载体，获得含PstI位点的RRSVRGSV-intron-RGSVRRSV片段；用PstI单酶切双T-DNA植物表达载体pMF_Ubi，用T4DNA连接酶将酶切后的pMF_Ubi载体和含PstI位点的RRSVRGSV-intron-RGSVRRSV片段连接，获得用于增强水稻对水稻锯齿叶矮缩病毒和水稻草状矮化病毒抗性的二价RNAi双T-DNA载体；引物iRRSV-XhoI-f262序列为：5'-CCGCTCGAGATTCGCAAGACAAGGCAAGA-3'；引物iRRSV-rgsv-r262序列为：5'-CTCCAGCATTCTCTTACCTGTGGCGTCAACCTCA-3'；引物iRGSV-BglII-f271序列为：5'-GCAGATCTTCAGACACACAGACTTGGTAACAC-3'；引物iRGSV-rrsv-r271序列为：5'-GCCACAGGTAAGAGAATGCTGGAGACAATGCTG-3'。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 福建农林大学 用于增强水稻对RRSV和RGSV病毒抗性的二价RNAi双T-DNA载体及方法

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