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具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体及其构建方法和应用 

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申请/专利权人:河南师范大学

摘要:本发明公开了一种具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体及其构建方法和应用,其是一种可以在复杂微生物环境中特异性清除肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体,该工程λ噬菌体的裂解酶基因被敲除并搭载CRISPR‑Cas3系统,利用工程λ噬菌体的溶源特性使CRISPR‑Cas3系统发挥高特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的作用,进而有效克服抗生素和野生型噬菌体治疗的广谱杀菌的弊端。

主权项:1.具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体,其特征在于:所述λ噬菌体的裂解酶基因被敲除并将CRISPR-Cas3系统相关基因Cas3、CasA、CasB、CasC、CasD、CasE、Cas1、Cas2以及合成的CrRNA插入到λ噬菌体中得到工程性λ噬菌体,通过λ噬菌体溶源作用将CRISPR-Cas3系统整合到宿主肠出血性大肠杆菌中,由CrRNA介导识别互补碱基序列从而发挥特异性杀菌功能,其中CRISPR-Cas3系统相关基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示,CrRNA基因的核苷酸序列如SEQIDNO:9所示;所述具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体的构建方法的具体过程为:步骤S1:CRISPR-Cas3系统相关基因的获得通过PCR的方法从E.coliMG1655菌株中获得CRISPR-Cas3系统相关基因Cas3、CasA、CasB、CasC、CasD、CasE、Cas1和Cas2,人工合成的CrRNA被设计成靶向肠出血性大肠杆菌的eae基因,CrRNA序列被克隆在pUC57质粒上,含有speI启动子和氨苄霉素抗性,该CrRNA能够引导Cas3切割含有与CrRNA碱基序列互补DNA片段;步骤S2:工程λ噬菌体的基因编辑对λ噬菌体插入位点设计gRNA,利用融合PCR原理将步骤S1中扩增的PCR产物与gRNA切割位点周围互补的700-1000bp的同源臂序列,同时在Cas9蛋白协助下得到工程λ噬菌体。

全文数据:

权利要求:

百度查询: 河南师范大学 具有特异性杀伤肠出血性大肠杆菌的工程λ噬菌体及其构建方法和应用

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