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申请/专利权人：开普敦大学

摘要：本发明涉及用于在植物中产生重组HIV糖蛋白多肽的方法，以及模拟天然HIVEnv复合物的重组的、植物产生的HIV糖蛋白多肽的三聚体复合物。本发明还涉及编码重组多肽的核酸，包含前述核酸的表达载体，以及使用重组多肽和三聚体复合物在对象中引发针对HIV之免疫应答的药物组合物、用途和方法。

主权项：1.用于产生能够形成三聚体Env糖蛋白复合物的经纯化重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：i提供编码具有下式的重组多肽的密码子优化的核苷酸序列：X1-X2-X3-X4其中，X1是分泌信号肽；X2是HIVgp120包膜多肽，其包含SEQIDNO:3的第22至489位氨基酸或SEQIDNO:8的第20至480位氨基酸；X3是接头肽，其中所述接头肽是包含氨基酸序列GGGGSGGGGS的柔性接头；并且X4是HIVgp41多肽，其中gp41多肽选自全长gp41多肽或截短的gp41多肽，并且其中如果gp41多肽是截短的gp41多肽，则其在gp41多肽的LALD基序之后被截短；此外，其中所述重组多肽包含I559P突变；以及其中所述重组多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:3或SEQIDNO:8；ii将编码所述重组多肽的密码子优化的核酸克隆到适于在植物细胞中表达所述重组多肽的表达载体中；iii用步骤ii的所述表达载体转化所述植物细胞；iv在所述植物细胞中表达所述重组多肽；v从所述植物细胞中回收所述重组多肽；以及vi纯化所述重组多肽。

全文数据：在植物中产生可溶性HIV包膜三聚体背景技术本发明涉及在植物中产生重组HIV糖蛋白多肽的方法和模拟野生型HIVEnv复合物的重组的、植物产生的HIV糖蛋白多肽的三聚体Env复合物trimericEnvcomplex。本发明还提供了编码重组HIV糖蛋白多肽的核酸，以及使用重组HIV糖蛋白多肽和三聚体复合物在对象中引发针对HIV之免疫应答的药物组合物、用途和方法。HIV大流行是全球公共卫生挑战，并且在发展中国家中特别成问题，这些国家经常受到不成比例的影响而且缺乏制备他们自己的疫苗所需的基础设施。目前HIV疫苗研究的主要焦点是开发能够诱导中和抗体的类天然包膜蛋白三聚体native-likeenvelopeproteintrimer。这些抗原通常通过转染哺乳动物细胞例如HEK293T、HEK293F、CHO-K1或GnTI--细胞系来产生。近年来，植物已成为常规表达平台的可行替代品，特别是在基础设施有限且成本过高的发展中国家。本发明涉及重组HIV糖蛋白多肽的产生，优选地，所述HIV糖蛋白多肽选自植物中的可溶性HIVEnvgp140模拟物、膜相关gp150模拟物、膜相关gp160模拟物或嵌合HIV多肽，其利用天然柔性接头在不存在弗林蛋白酶furin切割的情况下允许正确折叠。据本发明人所知，已在植物中成功表达的HIV-1包膜糖蛋白Env的最大部分，并且第一次表明植物能够重现蛋白质的三聚体结构。这也是表明已表达来自HIV亚型C分离株的可溶性gp140蛋白的第一份报道。重组蛋白显示出与从患有天然感染的人分离的数种原型单克隆抗体具有反应性。最重要的是，免疫原显示出与PGT145具有反应性，所述PGT145与良好有序的三聚体特异性地反应。这证实植物具有重现天然蛋白质之四级结构的能力。另外，抗原在兔中具有免疫原性，在单次免疫接种后诱导HIVEnv特异性抗体。据我们所知，这也是描述植物产生的HIV-1gp140抗原在动物中的免疫原性的唯一报道。很少有其他研究探索植物作为HIVEnv疫苗之表达平台的潜力。许多研究已成功地表达gp120的可变区或gp41的部分作为与植物病毒衣壳蛋白的融合物或使用霍乱毒素B作为载体。虽然这些疫苗具有免疫原性，但它们不太可能曾具有保护性，因为它们无法忠实地重现这些区的结构Rybicki，2010。最近，Kessans等已产生呈现本氏烟草植物中gp41的近膜端外部区membrane-proximalexternalregion，MPER的GagVLPKessansetal.，2016。迄今为止最有前景的研究由Rosenberg及同事进行，他们在本氏烟草植物中表达截短的可溶性Env蛋白。虽然没有报道抗原的免疫原性，但据报道该蛋白质与数种原型单克隆抗体反应Rosenbergetal.，2013。然而，由Rosenberg等产生的亚型BEnvgp140蛋白被广泛修饰以去除gp41的切割位点、融合肽和免疫显性区域。此外，没有证据表明由Rosenberg等产生的蛋白质能够形成三聚体或者它具有免疫原性。鉴于自研究以来对Env糖蛋白结构的后续洞见subsequentinsight，由于gp120和gp41界面处切割位点的截短，其阻止正确折叠的Env的形成，因此该蛋白质不太可能被正确加工，除非它被接头肽替代Ringeetal.，2013；Sharmaetal.，2015。此外，没有人以合理的产率在植物中成功表达完整的HIVEnvgp160蛋白或该蛋白质的主要部分Rybicki，2010。还提出虽然可能在某种程度上可确定提高植物中重组蛋白表达的途径，但这取决于许多根本不可预测的因素。例如，没有单一合适的宿主或产生体系，也没有单一的细胞器或出口目标选项Rybicki，2010。发明概述根据本发明的第一方面，提供了用于产生能够形成三聚体Env糖蛋白复合物的重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：i提供编码具有下式的重组多肽的密码子优化的核苷酸序列：X1-X2-X3-X4其中，X1表示分泌信号肽；X2表示HIVgp120包膜多肽；X3是接头肽；并且X4是HIVgp41多肽，其中gp41多肽选自全长gp41多肽或截短的gp41多肽，其中如果gp41多肽是截短的gp41多肽，则其在gp41多肽的LALD基序之后被截短；ii将编码所述重组多肽的密码子优化的核酸克隆到适于在植物细胞中表达所述重组多肽的表达载体中；iii用步骤ii的所述表达载体转化所述植物细胞；iv在所述植物细胞中表达所述重组多肽；以及v从所述植物细胞中回收所述重组多肽。在本发明的一个替代实施方案中，重组多肽具有下式：X1-X2-X3-X4-X5其中，X5是任选地被包含的，并且当被包含时，X5是具有跨膜结构域和胞质结构域的截短的流感病毒HA2分子。在一个实施方案中，重组多肽包含I559P突变。在第二个实施方案中，分泌信号肽是具有氨基酸序列MEWSWIFLFLLSGTAGVHSSGSEQIDNO：21的LPH。在第三个实施方案中，接头肽是包含氨基酸序列GGGGSGGGGSSEQIDNO：22的柔性接头。本领域技术人员将理解，可将多种另外的稳定化突变引入至本发明的序列，这些可包括但不限于引入人工二硫键以限制结构可塑性或其他突变以提高组装类天然三聚体的效率。在本发明的另一个实施方案中，植物细胞是本氏烟草植物细胞。然而，应当理解的是，可使用其他植物或植物细胞。在本发明的另一个实施方案中，应当理解，转化植物细胞的步骤可通过农杆菌介导的转化来进行。优选地，农杆菌是土壤农杆菌并且更优选地，土壤农杆菌菌株可选自LBA4404、GV3101pM90RK和AGL1。在本发明的第二方面，提供了能够形成根据本文中所述方法产生的三聚体Env糖蛋白复合物的重组多肽，其具有下式：X1-X2-X3-X4其中，X1表示分泌信号肽；X2表示HIVgp120包膜多肽；X3是接头肽；并且X4是HIVgp41多肽，其中gp41多肽选自全长gp41多肽或截短的gp41多肽，其中如果gp41多肽是截短的gp41多肽，则其在gp41多肽的LALD基序之后被截短。在一个替代实施方案中，重组多肽具有下式：X1-X2-X3-X4-X5其中，任选地包括X5，并且此外，其中X5是具有胞质和膜定位结构域的截短的流感病毒HA2分子。在本发明的第三方面，提供了包含三个重组多肽的三聚体Env糖蛋白复合物。本发明的第四方面提供了编码重组多肽的核酸，并且第五方面提供了包含该核酸的表达载体。本发明的另一方面提供了包含重组多肽或三聚体Env糖蛋白复合物的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物还包含可药用载体或辅料。在本发明的另一方面，提供了用于在对象中引发针对HIV之免疫应答的方法的本文中所述多肽、三聚体Env糖蛋白复合物或药物组合物，所述方法包括向所述对象施用有效量的多肽、三聚体Env糖蛋白复合物或药物组合物。应理解的是，在本发明的一个优选实施方案中，所述对象是人。在本发明的另一方面，提供了本文中所述的多肽或三聚体Env糖蛋白复合物用于制备药物的用途。在本发明的另一方面，提供了在对象中引发针对HIV之免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本发明多肽、三聚体Env糖蛋白复合物或药物组合物。应理解的是，在本发明的一个优选实施方案中，所述对象是人。附图简述现在将仅通过实例并参照以下附图来描述本发明的一些非限制性实施方案：图1：A天然gp160基因和Bgp140NFL抗原的编码序列的示意图。蛋白质的gp120和gp41部分用两个亚基界面处的天然切割序列REKR或柔性GGGGS2接头肽描绘。显示了gp41的胞外域Ecto、跨膜TM区和胞质CT区。对于gp140NFL抗原，反映了I559P螺旋断裂突变和编码序列终止处的第664位氨基酸残基的位置。天然和LPH信号序列分别由虚线箭头指示。图2：Western印迹检测重组HIV-1包膜蛋白在用表达ACAP256SU和BDu151gp140NFL的土壤农杆菌菌株入渗infiltrate的植物中的瞬时表达。由块突出显示的区域指示农杆菌入渗agroinfiltration之后5天蛋白质表达的峰。图3：在ACAP256和BDU151gp140NFL抗原纯化期间取样的流过级分的Western印迹。+’ve＝100ngHIV-1CN54gp120包膜，粗制crude＝粗制匀浆，F1＝匀浆的流过，将0.5MNaCl和PBS用于洗涤树脂，E1和E2分别＝洗脱液1和2，cone.gp140＝浓缩的gp140NFL蛋白图4：在SDS-PAGE和BN-PAGE凝胶上分离后，经纯化CAP256SU和Du151gp140NFL抗原的考马斯蓝染色。A和B分别示出了通过SDS-PAGE和BN-PAGE分离的CAP256SUgp140NFL，而C和D分别示出了通过SDS-PAGE和BN-PAGE分离的DU151gp140NFL。在B和D中将聚集体、三聚体、二聚体和单体的预期尺寸与BN-PAGE凝胶一起显示。图5：评估原型单克隆抗体与植物产生的CAP256SU和Du151gp140NFL之反应性的结合ELISA。将在稳定的HEK293细胞系中产生的等效抗原包括在内作为对照CAP256稳定且Du151稳定。图6：重组CAP256SUgp140NFL三聚体的纯化。A通过亲和色谱回收的分级Env种类的Superdex200Hiload16600洗脱曲线。指示了不同蛋白质种类的身份。B确定三聚体蛋白质的回收和污染的、非三聚体Env聚集体的去除的考马斯染色的BN-PAGE。将通过SEC分离的亲和纯化蛋白GNL与聚集体和三聚体样品一起运行，以用于进行比较。图7：在免疫接种方案过程中引发的结合抗体滴度。结合抗体的水平表示为产生基于2*第0周稀释范围的几何平均值的终点滴度所需的稀释倍数folddilution。每个时间点的误差棒以黑色表示，并且每次免疫接种的时间由图下方的红色箭头指示。图8：由经纯化CAP256SUgp140NFL三聚体在兔中引发的血清三聚体结合抗体。使用每个时间点的最小值+最小值的标准误差的阈值，将结合抗体水平作为从拟合的4点线性回归曲线推导的稀释倍数确定。每次免疫接种的时间由X轴下方的箭头指示。每个时间点的误差棒以黑色表示。图9：由经SEC纯化的三聚体和通过亲和色谱法GNL纯化的相同抗原引发的血清三聚体结合抗体滴度的比较。在A第3次和B第4次免疫接种之后将在该实验中引发的三聚体结合抗体与同伴文章companionarticle中所述的研究中引发的抗体进行比较。使用Mann-Whitney双尾未配对检验Mann-Whitneytwo-tailedunpairedtest进行组间的统计学比较*P＜0.05。图10：由SEQIDNO：14的核苷酸序列编码且与流感的HA2融合的CAP256SUGp140Gly的氨基酸序列SEQIDNO：4，将LPH氨基酸前导序列加下划线，柔性接头以斜体显示并且HA2氨基酸序列以粗体显示。图11：由SEQIDNO：15的核苷酸序列编码且与流感的HA2融合的CAP256SUGp120Gly的氨基酸序列SEQIDNO：5，将LPH氨基酸前导序列加下划线，柔性接头以斜体显示并且HA2氨基酸序列以粗体显示。图12：CAP256SUGp150Gly的氨基酸序列SEQIDNO：6并且其由SEQIDNO：16的核苷酸序列编码，将LPH氨基酸前导序列加下划线并且柔性接头以斜体显示。图13：CAP256SUGp160Gly的氨基酸序列SEQIDNO：7，将LPH氨基酸前导序列加下划线并且柔性接头以斜体显示。图14：由SEQIDNO：17的核苷酸序列编码且与流感的HA2融合的Du151Gp140Gly的氨基酸序列SEQIDNO：8，将LPH氨基酸前导序列加下划线，柔性接头以斜体显示并且HA2氨基酸序列以粗体显示。图15：由SEQIDNO：19的核苷酸序列编码且与流感的HA2融合的Du151Gp120Gly的氨基酸序列SEQIDNO：10，将LPH氨基酸前导序列加下划线，柔性接头以斜体显示并且HA2氨基酸序列以粗体显示。图16：Du151Gp150Gly的氨基酸序列SEQIDNO：11并且其由SEQIDNO：20的核苷酸序列编码，将LPH氨基酸前导序列加下划线并且柔性接头以斜体显示。图17：Du151Gp160Gly的氨基酸序列SEQIDNO：12，将LPH氨基酸前导序列加下划线并且柔性接头以斜体显示。图18：CAP256SUGp140NFL的氨基酸序列SEQIDNO：3，并且其由SEQIDNO：13的核苷酸序列编码，将LPH氨基酸前导序列加下划线并且柔性接头以斜体显示。图19：由SEQIDNO：18的核苷酸序列编码且与流感的截短HA2融合的Du151Gp140FL的氨基酸序列SEQIDNO：9，将LPH氨基酸前导序列加下划线，柔性接头以斜体显示并且HA2氨基酸序列以粗体显示。序列表使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的标准三字母缩写示出了所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。本领域技术人员将理解，仅显示每个核酸序列的一条链，但通过对所显示链的任何提及包括互补链。所附序列表在此通过引用整体并入。发明详述现在将参照附图在下文中更全面地描述本发明，附图中示出了本发明的一些但非全部实施方案。不应将所述的本发明限于所公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括在本发明的范围内。尽管本文中采用了具体术语，但它们仅以一般性和描述性意义使用，而不是出于限制的目的。除非上下文另有清楚地说明，否则在本说明书通篇和随后的权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个种或更多个种。本文中使用的术语和措辞是出于描述的目的并且不应被视为限制。本文中使用的术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”及其变化形式的使用意在涵盖其后列出的项目及其等同项目以及另外的项目。本发明涉及重组可溶性gp140多肽、重组膜相关gp150多肽、膜相关gp160多肽或嵌合HIV多肽。在重组多肽中，天然弗林蛋白酶切割位点已缺失并被氨基酸接头替代，优选地，所述氨基酸接头包含含有两个重复序列GGGGS的肽。在本发明的一个实施方案中，对多肽第559位处的异亮氨酸残基进行突变以被脯氨酸残基替代。在本发明的另一个实施方案中，编码序列在第664位氨基酸残基之后过早终止，并且这样做，重组多肽不包含gp41的跨膜区和或胞质区。在本发明的一个替代实施方案中，gp41多肽的编码序列不被截短并包含gp41的跨膜区和或胞质区。本申请人还将重组蛋白设计成包含LPH信号序列，以允许通过分泌途径进行靶向。本发明的重组gp140多肽、重组膜相关gp150多肽、膜相关gp160多肽或嵌合HIV多肽能够组装成三聚体。“蛋白质”、“肽”或“多肽”是两个或更多个氨基酸的任何链，其包括天然存在的或非天然存在的氨基酸或氨基酸类似物，不论翻译后修饰例如，糖基化或磷酸化。术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用并且涵盖核糖核苷酸RNA和脱氧核糖核苷酸DNA包括eDNA、基因组DNA和合成DNA二者。核酸可以是双链或单链的。在核酸是单链的情况下，核酸可以是有义链或反义链。核酸分子可以是两个或更多个共价键合的核苷酸包括天然存在的或非天然存在的核苷酸，或者核苷酸类似物或衍生物的任何链。“RNA”意指两个或更多个共价键合、天然存在或经修饰的核糖核苷酸的序列。术语“DNA”是指两个或更多个共价键合、天然存在或经修饰的脱氧核糖核苷酸的序列。术语“分离的”在本文中使用并且意指已从其天然环境中移出。术语“经纯化”涉及以基本上没有污染或污染物的形式分离分子或化合物。污染物通常与天然环境中的分子或化合物缔合，因此经纯化意指由于与原始组合物的其他组分分离而具有提高的纯度。术语“经纯化核酸”描述已经与其他化合物分离的核酸序列，所述其他化合物包括但不限于通常与其天然状态相关的多肽、脂质和碳水化合物。术语“互补”是指这样的两个核酸分子例如，DNA或RNA，其能够形成Watson-Crick碱基对以在所述两个核酸分子之间产生双链型区regionofdouble-strandedness。本领域技术人员将理解，核酸分子中的每个核苷酸不需要与相对的互补链中的核苷酸形成匹配的Watson-Crick碱基对以形成双链体。因此，如果一个核酸分子在高严格条件下与第二个核酸分子杂交，则其与第二个核酸分子“互补”。根据本发明的核酸分子包括两个互补分子。本文中使用的“基本上相同”的序列是这样的氨基酸或核苷酸序列，其与参考序列的区别仅在于：一个或更多个保守替换，或者位于不破坏或基本上降低一种或更多种表达的多肽或由核酸分子编码的多肽的抗原性的序列位置处的一个或更多个非保守替换、缺失或插入。可以以本领域技术人员知识范围内的多种方式实现为了确定百分比序列同一性目的的比对。这些包括例如使用计算机软件，例如ALIGN、MegalignDNASTAR、CLUSTALW或BLAST软件。本领域技术人员可容易地确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在本发明的一个实施方案中，提供了与本文中所述序列具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性的多肽或多核苷酸序列。作为替代或补充，如果两个核酸序列在高严格条件下杂交，则它们可以是“基本上相同”的。杂交反应的“严格”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验计算。通常来说，较长的探针需要较高的温度以进行适当的退火，而较短的探针需要较低的温度。当互补链存在于低于其解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA重新退火的能力。这样的“严格”杂交条件的典型实例会是在65℃下轻轻振荡进行杂交持续18小时，在65℃下在洗涤缓冲液A0.5％SDS；2×SSC中进行第一次洗涤持续12分钟，并在65℃下在洗涤缓冲液B0.1％SDS；0.5％SSC中进行第二次洗涤持续10分钟。本领域技术人员将理解，可使用标准化学技术例如，通过使用溶液或固相合成方法的自动合成来合成多肽、肽或肽类似物。自动肽合成器可商购获得并使用本领域中已知的技术。多肽、肽和肽类似物也可使用重组DNA技术由它们相应的核酸分子来制备。本文中使用的术语“基因”是指编码功能产物例如RNA、多肽或蛋白质的核酸。基因可包括编码功能产物的序列的上游或下游的调节序列。本文中使用的术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的核酸序列。另一方面，“调节序列”是指位于编码序列的上游、下游或内部的核苷酸序列。通常来说，调节序列影响转录、RNA加工或稳定性，或者相关编码序列的翻译。调节序列包括但不限于：效应子结合位点、增强子、内含子、聚腺苷酸化识别序列、启动子、RNA加工位点、茎-环结构、翻译前导序列等。在一些实施方案中，在本发明方法中使用的基因可与其他序列可操作地连接。“可操作地连接”意指编码重组gp140抗原多肽、重组gp150抗原多肽、gp160抗原多肽或本发明的嵌合HIV抗原多肽的核酸分子与调节序列以这样的方式连接，即当合适的分子与调节序列结合时允许蛋白质的表达。这样的可操作地连接的序列可包含在可被转化或转染到宿主细胞中用于表达的载体或表达构建体中。作为替代地，可将可操作地连接的序列转化到细菌载体中以介导在植物中的表达。应理解的是，任何载体可用于表达本发明的重组抗原性多肽的目的。术语“启动子”是指能够控制核酸编码序列或功能RNA之表达的DNA序列。启动子可完全基于天然基因，或者它可由来自天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者启动子可以是完全合成的构建体。不同的启动子能够指导基因在不同细胞类型中，或在不同发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件的表达。“组成型启动子”是大多数时间在大多数宿主细胞类型中指导目的基因表达的启动子。术语“重组”意指某物已被重新组合。当涉及核酸构建体使用时，该术语是指包含借助于分子生物学技术连接在一起或产生的核酸序列的分子。当用于提及蛋白质或多肽时，术语“重组”是指从借助于分子生物学技术产生的重组核酸构建体表达的蛋白质或多肽分子。重组核酸构建体可包括与未与其天然连接或在不同位置处天然连接的核酸序列连接或被操纵以与所述核酸序列连接的核苷酸序列。因此，重组核酸构建体表明已使用基因工程即通过人为干预对该核酸分子进行操纵。可通过转化将重组核酸构建体引入到宿主细胞中。这样的重组核酸构建体可包括来源于相同宿主细胞种类或来自不同宿主细胞种类的序列。本文中使用的术语“嵌合”意指序列由已“重组”的序列构成。举例来说，序列是重组的并且不是天然一起存在的。术语“重新组合”或“重组”是指连接两个或更多个多核苷酸的任何方法。该术语包括端至端连接endtoendjoining，以及将一个序列插入到另一个序列中。该术语旨在包括物理连接技术，例如，黏端连接、平端连接，以及通过重叠延伸PCR的PCR介导的融合。序列也可人工合成以包含重组序列。该术语还可涵盖通过例如同源重组将一个序列整合到第二个序列中。术语“载体”是指可将多核苷酸或基因序列引入到细胞中的工具。本领域中已知有多种类型的载体，包括质粒、病毒、噬菌体和黏粒。通常借助于盒cassette将多核苷酸或基因序列引入到载体中。术语“盒”是指从载体表达的多核苷酸或基因序列，例如编码本发明的酰基转移酶多肽的多核苷酸或基因序列。盒通常包含插入到载体中的基因序列，其在一些实施方案中提供用于表达多核苷酸或基因序列的调节序列。在另一些实施方案中，载体提供用于表达酰基转移酶多肽的调节序列。在另一些实施方案中，载体提供一些调节序列，并且核苷酸或基因序列提供另一些调节序列。“调节序列”包括但不限于启动子、转录终止序列、增强子、剪接受体、供体序列、内含子、核糖体结合序列、多A添加序列polyAadditionsequence和或复制起点。重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原和或嵌合HIV抗原或者包含这些抗原的本发明组合物可在存在脂质体、辅料或任何载体例如可药用载体的情况下，并以适于施用于哺乳动物例如，人、牛、绵羊等的形式单独提供或与其他化合物例如，核酸分子、小分子、肽或肽类似物组合提供。在本发明的一个实施方案中，配制本发明的三聚体蛋白质以与佐剂一起免疫接种。佐剂是疫苗开发领域的技术人员公知的，并且不限于本文中具体例示的佐剂。本文中使用的“可药用载体”或“赋形剂”包括生理上相容的任何和全部抗细菌剂和抗真菌剂、包衣、分散介质、溶剂、等张剂和吸收延迟剂等。“可药用载体”可包括可安全地用于向对象施用重组抗原或疫苗组合物的固体或液体填充剂、稀释剂或者包封物质。可药用载体可适用于肌内、皮内、静脉内、腹膜内、皮下、经口或舌下施用。可药用载体包括用于制备无菌溶液的无菌水溶液、分散体和无菌粉末。用于制备药物活性物质的介质和试剂的使用是本领域中公知的。当任何常规介质或试剂与活性化合物不相容时，不考虑将其用于本发明的药物组合物中。补充的活性化合物也可被并入到组合物之中。将重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽和组合物施用于感染HIV的对象或具有与HIV感染相关病症发生症状前的对象的合适制剂或组合物均落入本发明的范围内。可采用任何合适的施用途径，例如肠胃外、静脉内、皮下、肌内、颅内、眶内intraorbital、眼科、室内intraventricular、囊内、椎管内intraspinal、鞘内、脑池内intracistemal、腹膜内、鼻内、气雾剂、表面topical或经口施用。对于疫苗制剂和药物组合物，可与免疫佐剂例如，氢氧化铝二甲基二十八烷基氢氧化铵或弗氏不完全佐剂一起，单独或与其他化合物组合提供有效量的重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽或本发明组合物。也可将重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽或本发明组合物与合适的载体和或其他分子例如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白keyholelimpethaemocyanin连接，以便增强免疫原性。在一些实施方案中，重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽或根据本发明的组合物可在药盒kit中，任选地与载体和或辅料以及使用说明书一起提供。重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽或者根据本发明的组合物的“有效量”包括治疗有效量、免疫有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指以必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果例如治疗感染或与这样的感染相关的病症的量。可例如通过病毒血症的降低、病毒基因表达的抑制、与HIV感染相关的病理状况的发生的延迟、免疫系统的刺激或确定治疗益处的任何其他方法来测量治疗的结果。化合物的治疗有效量可根据例如疾病状态、年龄、性别和个体体重的因素以及化合物在个体中引发期望响应的能力而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。治疗有效量也是其中治疗有益作用超过化合物的任何毒性或有害作用的量。重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽或本发明组合物中任一种的剂量将根据对象的症状、年龄和体重，待治疗或预防的病症的性质和严重程度，施用途径以及组合物的形式而变化。任何本发明的组合物可以以单剂量或多剂量施用。本发明组合物的剂量可通过本领域技术人员已知的或本文中所教导的技术容易地确定。“免疫原性有效量”意指以必要的剂量和时间段内有效实现期望的免疫应答的量。期望的免疫应答可包括刺激或引发免疫应答，例如T细胞应答。“预防有效量”是指以必要的剂量和时间段内有效实现期望的预防结果例如预防与HIV感染相关的病症的发作的量。通常来说，将预防剂量在疾病之前或疾病的早期阶段用于对象，因此预防有效量可小于治疗有效量。剂量值可变化，并根据个体需要和施用重组gp140抗原、重组gp150抗原、重组gp160抗原或嵌合HIV抗原多肽或者本发明组合物的人或者监督其施用的人的判断来随时间进行调整。本文中所示剂量范围仅是示例性的，并不限制可选择的剂量范围。组合物中活性化合物的量可根据例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重的因素而变化。可调整剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可施用单剂量，或者可随时间施用多剂量。为了便于施用和剂量均一性，将组合物配制成剂量单位形式可以是有利的。当与感染性疾病或其他医学疾病或病症相关使用时，术语“预防”在本领域中很好理解，并且包括施用这样的组合物，其在对象中降低病症的频率或延迟病症症状的发作相对于未接受该组合物的对象。预防疾病包括，例如，相对于未经治疗的对照人群，在经治疗人群中降低感染的诊断数目，和或相对于未经治疗的对照人群，在经治疗人群中延迟感染症状的发作。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域技术人员公知的，并且包括向对象施用一种或更多种本发明的组合物。如果组合物在临床表现出不需要的病症例如，对象的疾病或其他不需要的状态之前施用，那么治疗是预防性的，即，它保护宿主免于发生不需要的病症，而如果在表现出不需要的病症之后施用，那么治疗是治疗性的即，其旨在降低、改善或稳定现有的不需要的病症或其副作用。可通过细胞培养中的标准药学操作或使用实验动物，例如通过确定LD50和ED50来确定本发明组合物的毒性和治疗效力。从细胞培养和或动物研究获得的数据可用于配制用于对象的剂量范围。任何本发明组合物的剂量优选处于包括ED50但几乎没有或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。对于本发明的组合物，最初可通过细胞培养测定评估治疗有效剂量。通过举例说明而不是通过限制来提供以下实施例。实施例1抗原设计和克隆到pEAQ-HT中来自HIV-1亚型CCAP256SU病毒克隆256.2.06.c7的全长gp160包膜的编码序列SEQIDNO：1由PennyMoore博士约翰内斯堡Johannesburg国家传染病研究所NationalInstituteforCommunicableDiseasesHIV和STI中心的高级医学科学家提供。从GenBank登录号AF544008.1检索Du151包膜序列SEQIDNO：2。基于天然柔性接头方法设计可溶性gp140抗原，以使其能够在不存在弗林蛋白酶切割的情况下产生类天然三聚体Sharmaetal.，2015。用10个氨基酸的柔性接头替换天然HIVEnv切割位点，所述接头包含基于甘氨酸-丝氨酸GGGGS基序的2个重复序列。将gp41的N端七肽重复序列中的第559位残基处的异亮氨酸突变为脯氨酸，并且通过在第664位氨基酸残基之后引入终止密码子过早终止编码序列。对基因编码序列进行优化以反映优选的人密码子使用以及分别添加至基因的5′和3′端的Age1和Xho1限制位点。最后，用鼠mAB24重链来源的LPH信号肽替换天然信号序列，以指导重组蛋白通过植物分泌途径的转运图1。合成基因以反映最佳人密码子使用；重组CAP256gp140多肽示于SEQIDNO：3中，并且重组Du151gp140多肽示于SEQIDNO：8中，并随后克隆到由GeorgeLomonossoff博士生物化学系，JohnInnesCentre，Norwich，UK提供的pEAQ-HT表达盒中。然后将重组质粒转化到土壤农杆菌AGL1中。以类似方式合成重组CAP256SUgp120SEQIDNO：5、与流感的HA2融合的gp140SEQIDNO：4、gp150SEQIDNO：6和gp160SEQIDNO：7多肽，以及重组Du151gp120SEQIDNO：10、与流感的HA2融合的gp140SEQIDNO：9、gp150SEQIDNO：11和gp160SEQIDNO：12多肽。实施例2植物中的小规模瞬时表达将调节至OD600＝1的密度的重组土壤农杆菌AGL1的培养物真空入渗到4至6周龄的本氏烟草植物中。在规定的16小时光照8小时黑暗光循环下，将植物在22℃下孵育。隔天从叶中收获粗制总可溶性蛋白质，持续9天时间。从农杆菌入渗的叶收获6个叶剪下物leafclipping每株植物2片叶，每片叶1个剪下物，并在液氮中精细研磨。将叶材料重悬于补充有cOmpleteTM无EDTA蛋白酶抑制剂Roche的300μlPBS中，并在4℃下摇动孵育1小时。通过以14000rpm离心15分钟使植物浆液澄清，并将上清液保持在4℃下。通过western印迹验证重组蛋白的表达。CAP256SU抗原和DU151gp140抗原二者的低水平在入渗之后3天是明显的，并且显示出在第5天的表达达峰。在这两种情况下，western印迹揭示在预期的140kDa大小的区域中有微弱的条带，以及在高于170kDa分子量标记有不清楚的条带图2。推断这些较大产物是通过SDS-PAGE未完全分离的聚集体。实施例3大规模表达和纯化将重组土壤农杆菌培养物按比例放大至2.5升，其能够真空入渗50至70株植物。在农杆菌入渗之后5天收获植物的地上部分，并将其在补充有cOmpleteTM无EDTA的蛋白酶抑制剂Roche的2个缓冲液体积的PBS中匀浆。将粗制匀浆在4℃下摇动孵育1小时，并随后通过4层MiraclothMerck过滤。然后通过连续离心步骤使粗制植物液汁plantsap澄清；在15344×g下持续20分钟，两次，并随后再在17000×g下持续20分钟。将上清液通过0.22μMStericup-GP装置MerckMillipore真空过滤，并以0.25至0.5mlmin的流量施加至Galanthuisnivalis凝集素柱Sigma。依次用100ml0.5MNaCl和随后的100mlPBSLonza洗涤柱。用1M甲基αD-吡喃甘露糖苷methylαD-manno-pyranoside，MMPSigma填充柱，孵育30分钟并将蛋白质在40ml中洗脱。第二次重复洗脱步骤，洗脱体积为20ml。将经洗脱的蛋白质缓冲交换到PBS中，并使用具有30kDa截止的Vivaspin蛋白质浓缩器GEHealthcare进行浓缩。对取自纯化过程期间流过柱的样品进行使用多克隆抗gp120抗体的Western印迹。高效结合至树脂的粗制蛋白质提取物中的低水平表达是明显的。在流过中检测到低水平的蛋白质，在2个洗涤步骤中观察到的抗原损失最小。将蛋白质高效洗脱主要在第一次洗脱期间并随后浓缩。对于浓缩蛋白质观察到的涂片是由于过载图3A和图3B。在标准SDS-PAGE凝胶以及BN-PAGE凝胶其能够在天然条件下分离蛋白质上进行考马斯亮蓝染色。CAP256SU和Du151gp140NFL二者的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色产生恰好低于135kDA和高于245kDa分子量标记的明显带图4A和图4C。使用LCMS通过CPGR将这两个条带的身份独立验证为HIV包膜。内源植物蛋白质的低污染水平在80kDa标记下方是明显的。BN-PAGE揭示CAP256SU和Du151gp140NFL抗原二者的主要产物是三聚体图4B和图4D。还存在聚集体和单体二者。实施例4用原型广泛中和单克隆抗体进行表征通过在间接结合ELISA测定中评价原型单克隆抗体与经纯化蛋白质的反应性确定植物产生的抗原重现天然糖蛋白结构的能力。还将每种单克隆抗体的反应性与哺乳动物细胞培养中产生的等同蛋白质的反应性进行比较，作为独立研究的一部分。通过雪花莲凝集素亲和色谱对来自经转染HEK293细胞的这些蛋白质进行纯化。表1：用于探询植物产生的gp140NFL抗原结构的原型单克隆抗体的总结。*OD＝外域outerdomain在4℃下，将96孔微量滴定板NunC用100μl的1μgml经纯化HIVgp140蛋白包被过夜。将板用200μlPBS洗涤3次，并在室温下用PBS中的200μl5％脱脂乳粉Oxoid封闭1小时。将板用含有0.1％20Sigma的PBS洗涤5次，并与在PBS中的2.5％脱脂奶粉中连续稀释的人单克隆抗体一起孵育2小时。如前重复洗涤步骤，并将板与1∶5000稀释的多克隆兔抗人IgGHRPDako一起孵育1小时。重复洗涤步骤并通过添加100μlTMBELISA底物高敏感性使板显影。10分钟后通过添加100μl1NH2SO4使反应终止，并在450nm处读取信号。所有样品与阴性对照一起一式三份地运行，从而省略一抗。包括包含山羊抗HIV-1gp120一抗AbDSerotec的阳性对照，所述一抗用1∶5000多克隆兔抗山羊免疫球蛋白HRPDako进行检测。使用GraphPadPrism5将数据绘制为4点线性回归。大多数抗体与植物产生的抗原和来源于哺乳动物的抗原二者的结合也观察到类似的趋势图5。与在核心表位中具有部分逃逸突变escapemutation的Du151相比，CAP256SUgp140NFL抗原表现出与VRC01更高水平的结合。N332依赖性抗体PGT128和PGT135二者均表现出与植物产生的抗原较高的反应性。对于将良好有序的糖蛋白与错误折叠的包膜区分开的三聚体优选抗体，也观察到类似的反应性。植物产生的抗原与PG9低水平结合是明显的。这两种植物产生的抗原均未显示出与PG16的任何反应性。没有看到多克隆抗体结合的明显差异，证实ELISA板上的蛋白质水平是相当的。总之，数据确认植物可重现四级结构依赖性表位，包括依赖于聚糖的那些。数据还显示经纯化蛋白质的一部分包含良好有序的三聚体，并且这与来源于哺乳动物细胞的蛋白质相当。最后，与哺乳动物细胞例如CHO系相比，植物产生的抗原可更好地重现见于人天然Env中的高甘露糖依赖性表位。实施例5三聚体HIVEnvgp140三聚体的精制回收从GNL亲和树脂洗脱后，将重组蛋白浓缩并缓冲交换到5mlPBSLonza中。然后使用Superdex200HiLoad16600柱GEHealthcare基于大小对经纯化蛋白质进行分级分离。将对应于三聚体蛋白质的级分合并，并在必要时使用具有30kDa截止的Vivaspin蛋白质浓缩器GEHealthcare进一步进行浓缩。洗脱曲线确认了不同Env种类的成功分离，使得能够从受到污染的聚集体、单体和内源植物蛋白质中回收三聚体蛋白质。BN-PAGE凝胶的考马斯染色确定从经亲和纯化蛋白质中去除受到污染的聚集体以产生经纯化三聚体图6。实施例6用亲和纯化的gp140NFL抗原对兔进行免疫接种根据适当的伦理委员会AEC014-30的指导方针和批准，在开普敦大学theUniversityofCapeTown进行兔免疫接种和血液采样。用50μg混悬于佐剂2％Invivogen的重组蛋白浓度为1∶1抗原∶佐剂对3个月大的新西兰白兔进行免疫接种。对5只兔子的组进行肌内免疫接种到后腿的股四头肌中。在第0、4、12和20周对动物进行免疫接种，并在第0、4、8、12、16、20和24周抽取血液用于分析。通过间接结合ELISA确定经免疫接种动物的血清中结合抗体的水平，对先前描述的方案进行微小的改变。简单地说，将96孔微量滴定板NunC用10ng在哺乳动物细胞中产生的重组CAP256SU或Du151gp140NFL蛋白包被过夜。将一抗稀释物在板上孵育过夜。没有其他偏离原始方案的地方。所有经免疫接种的兔在单次免疫接种后产生可检测的结合抗体，并且在3次接种后观察到峰值结合抗体滴度图7。经免疫接种的动物还产生针对数种1级tier1病毒分离株的中和抗体表2。表2.由CAP256SU和Du151gp140NFL抗原诱导的纵向中和抗体。在第0、4、12和20周对动物进行免疫接种。在实验过程中评估来自经免疫接种动物的血清针对Env-假型病毒粒子组panelofEnv-pseudotypedvirion的中和活性。每种病毒的中和表示为感染性病毒进入到报道细胞系的50％降低所需的血清稀释度ID50。WK＝周实施例7用尺寸排阻色谱纯化的gp140NFL抗原对兔进行免疫接种根据UCT动物伦理委员会AEC014-30的指导方针和批准，使用新西兰白兔在斯泰伦博斯大学动物单元AnimalUnitoftheUniversityofStellenbosch进行免疫原性研究。用50μg经纯化三聚体以1∶1v∶v抗原∶佐剂的浓度配制在佐剂2％Invivogen中对兔进行免疫接种。在第0、4、12和20周，在后腿的股四头肌对动物进行肌内免疫接种。在第0、4、8、12、14、16、20、22和24周抽取血液用于分析。24周后终止实验。如前使用在哺乳动物细胞中产生的等同蛋白质通过SEC纯化至大小均一对血清结合抗体进行量化。这使得能够对特异性识别三聚糖蛋白的抗体进行量化，三聚糖蛋白比单体或聚集体更真实地代表蛋白质。所有经免疫接种的动物都产生了稳健的三聚体结合抗体图8和改善的中和抗体表3。三聚体结合抗体滴度的比较确认了经SEC纯化的三聚体比先前使用的亲和纯化三聚体更具免疫原性图9。表3.由CAP256SUgp140NFL三聚体诱导的血清ID50中和抗体滴度。在第0、4和12和20周用50μg三聚体蛋白对动物进行免疫接种。在实验过程中评估来自经免疫接种动物的血清针对标准的Env-假型病毒粒子组的中和活性。每种假病毒的中和表示为感染性病毒进入到报道细胞系的50％降低所需的血清稀释度ID50。WK＝周参考文献Rybicki，E.P.，2010Plant-madeVaccinesforHumansandAnimals.PlantBiotechnolJ8，620-637.Kessans，S.A.etal.，2016ImmunologicalCharacterizationofPlant-BasedHIV-1GagDgp41Virus-LikeParticles.PLoSOne11，e0151842.Rosenberg，Y.etal.，2013Rapidhigh-levelproductionoffunctionalHIVbroadlyneutralizingmonoclonalantibodiesintransientplantexpressionsystems.PLoSOne8，e58724.Ringe，R.P.etal.，2013CleavagestronglyinfluenceswhethersolubleHIV-1envelopeglycoproteintrimersadoptanative-likeconformation.ProcNatlAcadSciUSA110，18256-18261.Sharma，S.K.etal.，2015Cleavage-independentHIV-1Envtrimersengineeredassolublenativespikemimeticsforvaccinedesign.CellRep11，539-550.

权利要求：1.用于产生能够形成三聚体Env糖蛋白复合物的重组多肽的方法，所述方法包括以下步骤：i提供编码具有下式的重组多肽的密码子优化的核苷酸序列：X1-X2-X3-X4其中，X1是分泌信号肽；X2是HIVgp120包膜多肽；X3是接头肽；并且X4是HIVgp41多肽，其中gp41多肽选自全长gp41多肽或截短的gp41多肽，并且其中如果gp41多肽是截短的gp41多肽，则其在gp41多肽的LALD基序之后被截短；此外，其中所述重组多肽包含I559P突变；ii将编码所述重组多肽的密码子优化的核酸克隆到适于在植物细胞中表达所述重组多肽的表达载体中；iii用步骤ii的所述表达载体转化所述植物细胞；iv在所述植物细胞中表达所述重组多肽；以及v从所述植物细胞中回收所述重组多肽。2.权利要求1所述的方法，其中所述分泌信号肽是LPH。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述接头肽是包含氨基酸序列GGGGSGGGGS的柔性接头。4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物细胞是本氏烟草Nicotianabenthamiana细胞。5.能够形成三聚体Env糖蛋白复合物的重组多肽，其中所述重组多肽根据权利要求1至4中任一项所述的方法产生，所述重组多肽包含下式：X1-X2-X3-X4其中，X1是分泌信号肽；X2是HIVgp120包膜多肽；X3是接头肽；并且X4是HIVgp41多肽，其中gp41多肽选自全长gp41多肽或截短的gp41多肽，并且其中如果gp41多肽是截短的gp41多肽，则其在gp41多肽的LALD基序之后被截短；此外，其中所述重组多肽包含I559P突变。6.三聚体Env糖蛋白复合物，其包含三个权利要求5所述的重组多肽。7.编码权利要求5所述重组多肽的核酸。8.表达载体，其包含权利要求7所述的核酸。9.药物组合物，其包含权利要求5所述的重组多肽或权利要求6所述的三聚体Env糖蛋白复合物。10.权利要求9所述的药物组合物，其还包含可药用载体或辅料。11.权利要求5所述的重组多肽、权利要求6所述的三聚体Env糖蛋白复合物或权利要求9所述的药物组合物，其用于在对象中引发针对HIV之免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的所述多肽或三聚体Env糖蛋白复合物。12.权利要求11所述应用的重组多肽、三聚体Env糖蛋白复合物或药物组合物，其中所述对象是人。13.权利要求5所述的重组多肽或权利要求6所述的三聚体Env糖蛋白复合物用于制备药物的用途。14.在对象中引发针对HIV之免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求5所述的重组多肽、权利要求6所述的三聚体Env糖蛋白复合物或权利要求9所述的药物组合物。15.权利要求14所述的方法，其中所述对象是人。

百度查询： 开普敦大学 在植物中产生可溶性HIV包膜三聚体