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申请/专利权人：浙江工业大学
摘要：本发明公开了一种应用于放线菌中基因拷贝数自主扩增并广泛分散于染色体上的方法，采用基于复制叉依赖的串联扩增系统，以不可逆的位点特异性重组替代同源臂依赖的同源重组，结合其他位点特异性重组系统或转座子重组系统将扩增的基因整合至其他整合位点，分散插入在染色体上不同位置，使基因拷贝之间存在间隔，增加其稳定性，最终实现报告基因稳定多拷贝倍增。本发明的方法通过串联扩增提高基因拷贝数，还通过位点整合的方式，实现基因在染色体不同位置上的分散插入，使基因拷贝之间存在间隔，避免了因重复大片段同源重组所导致的基因丢失问题，确保基因组的稳定性和目标基因的高效表达，无需依赖高浓度抗生素来维持，更有利于在工业应用中的推广。
主权项：1.一种应用于放线菌中基因拷贝数自主扩增并广泛分散于染色体上的方法，其特征在于，包括步骤：1）构建用于目的基因拷贝数自主扩增并广泛分散于染色体上的重组质粒，所述质粒包含与底盘宿主菌株染色体上共有的用于同源重组的同源臂序列、不可逆的特异性重组位点attp序列、其他特异性重组系统位点attp序列或转座子重组系统位点IR序列、可在放线菌中进行抗性筛选的抗性基因、不可逆的特异性重组位点attb序列，上述功能元件依次排布在该重组质粒中；2）构建整合酶重组质粒，该质粒包含步骤1）所述质粒的不可逆的特异性重组位点对应的重组酶，以及包含其他特异性重组位点对应的重组酶或转座子重组位点对应的转座子；3）将步骤1）所述重组质粒导入到表达底盘菌株体内，并以同源重组单交换的方式整合到所述菌株的染色体上，得到突变型表达底盘菌株；4）步骤2）所述整合酶重组质粒要导入到步骤3）的突变型表达底盘菌株中，菌株在DNA复制过程中形成复制叉，由整合酶介导重组的发生，实现基因拷贝数的倍增。
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百度查询： 浙江工业大学 一种应用于放线菌中基因拷贝数自主扩增并广泛分散于染色体上的方法
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