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申请/专利权人：江苏格诺生物科技集团有限公司

摘要：本发明公开一种免疫磁珠负向富集循环肿瘤细胞的方法，本方法包括以下步骤：S1、制备样本；S2、红细胞裂解和S3、去除白细胞，其中：S1、制备样本：打开采血管后，用移液管移取4‑5mL全血样本至离心管中；S2、红细胞裂解：包括a、初次裂解；b、二次裂解；S3、去除白细胞：包括c、初次去白细胞和d、二次去白细胞。本发明采取两次红细胞裂解步骤与两次白细胞去除步骤结合的方式，不仅高效地去除了红细胞与白细胞残留，也简化了操作步骤，缩短了操作时间，同时定制的高特异性磁珠能够进一步高效的去除白细胞残留。

主权项：1.一种免疫磁珠负向富集循环肿瘤细胞的方法，其特征在于：本方法包括以下步骤：S1、制备样本；S2、红细胞裂解和S3、去除白细胞，其中：S1、制备样本：打开采血管后，用移液管移取4-5mL全血样本至离心管中；S2、红细胞裂解：包括a、初次裂解；b、二次裂解，其中：a、初次裂解：用10mL移液管取红细胞裂解液，加入25mL至血样，轻轻颠倒充分混匀，将样本置于低温环境中裂解，15-20min后，进行离心，离心结束后，吸弃上清液；b、二次裂解：按照步骤a的方式加入30mL红细胞裂解液进行二次裂解，吸弃上清液，加入10mL分离缓冲液洗涤细胞，离心后吸弃上清液，加入200-230μL分离缓冲液重悬细胞，并将重悬液转移至新的1.5mL离心管；S3、去除白细胞：包括c、初次去白细胞和d、二次去白细胞，其中：c、初次去白细胞：取1-2mL分离缓冲液于1.5mL离心管中，将磁珠溶液涡旋震荡20.0-22.0sec，充分混匀后，取一定量的磁珠置于该1.5mL离心管中，混匀后置于磁力架中，在2-3min，吸弃上清液，取与原磁珠量等体积的分离缓冲液重悬磁珠，取100μL洗涤好的磁珠，加入到准备好的细胞样品，混匀，置于混旋仪上，进行孵育，孵育结束后，将上述样品取出，加入600-640μL分离缓冲液混匀，置于磁力架上，静置10-12min，静置结束后，用移液器小心将管内的上清液全部转移至新的1.5mL离心管中，进行离心，离心结束后，吸弃上清液，然后加入350-380μL分离缓冲液重悬细胞；所述一定量的磁珠为150μL样本；d、二次去白细胞：取50μL洗涤好的磁珠，加入至重悬细胞中，混匀，置于混旋仪上，进行孵育，孵育结束后，将上述样品取出，加入600-640μL分离缓冲液混匀，置于磁力架上，静置10-12min，静置结束后，用移液器小心将管内的上清液全部转移至新的1.5mL离心管中，进行离心，离心结束后，吸弃上清液，加入适当体积分离缓冲液重悬细胞，得到去除红细胞和白细胞的样本；所述混旋仪上的转速为8-10rpm；所述a中低温环境中裂解是将样本置于2-8℃冰箱中，期间每4-5min轻轻颠倒并在离心管底拍打混匀几次；所述a和b中均在4-8℃，500-700g的条件下进行离心，离心10-12min；所述b中裂解时长10-12min，并且将重悬液转移至新的1.5mL离心管后，再以300-335μL分离缓冲液冲洗原50mL离心管，并将所有悬液转移至前述1.5mL离心管；所述c和d中所使用的磁珠为结合抗CD45抗体的直径1μm的磁珠。

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