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申请/专利权人：华东理工大学;上海浩思海洋生物科技有限公司
摘要：本发明涉及一种基于CRISPRi的杀鱼爱德华氏菌减毒靶点的高通量筛选方法和应用。本发明在杀鱼爱德华氏菌中建立了基于CRISPR‑Cas9系统的基因靶向干扰系统CRISPRinterference,CRISPRi，并结合高通量测序技术建立CRISPRi‑seq技术平台，以及适应于体内条件必需基因筛查的PACE2.0方法，可以鉴定杀鱼爱德华氏菌在感染条件下的全基因组范围内包含必需基因和短基因的适应性决定因子，探究杀鱼爱德华氏菌致病机制，揭示减毒活疫苗开发的新型靶点。
主权项：1.一种基于CRISPRi的杀鱼爱德华氏菌减毒靶点的高通量筛选方法，其特征在于，具体步骤如下：S1、构建ParaB-dcas9菌株：将up、ParaB-dcas9和down片段连接到质粒骨架上，形成质粒，整合诱导后去除质粒骨架，得到ParaB-dcas9菌株；S2、构建感受态菌株：制备步骤S1中得到的ParaB-dcas9菌株的感受态，得到感受态菌株；S3、合成sgRNA质粒文库：设计靶向全基因组间隔序列，合成寡核苷酸文库，合成寡核苷酸文库与sgRNA质粒进行无缝克隆，得到sgRNA质粒文库；S4、构建CRISPRi敲降文库菌株：将步骤S3中得到的sgRNA质粒文库电转至步骤S2中得到的感受态菌株中，得到CRISPRi敲降文库菌株；S5、筛选杀鱼爱德华氏菌毒力因子：将步骤S4中得到的CRISPRi敲降文库菌株感染大菱鲆，以感染后的大菱鲆进行脏器培养，经抗性筛选，构建高通量测序文库，测序验证，筛选杀鱼爱德华氏菌毒力因子。
全文数据：
权利要求：
百度查询： 华东理工大学 上海浩思海洋生物科技有限公司 一种基于CRISPRi的杀鱼爱德华氏菌减毒靶点的高通量筛选方法和应用
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