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申请/专利权人：重庆三峡学院

摘要：本发明涉及中药材病原菌检测领域，具体是一种金银花根腐病病原菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：S1：病样采集：采集金银花种植基地中生长不良，带有根部病害的金银花植株，并取表面0‑4mm的根际土壤，分别放入密封袋，带回实验室；S2：病原菌的分离和纯化S3：S4：PCR扩增与鉴定。本发明相对于现有的金银花根腐病病原菌分离和纯化方法，分离和纯化时间得到极大的缩减，帮助工作人员快速确定金银花根腐病病原菌的种类，操作方法简单，是非常适合本领域技术人员掌握的金银花根腐病病原菌分离方法。

主权项：1.一种金银花根腐病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：病样采集：采集金银花种植基地中生长不良，带有根部病害的金银花植株，并取表面0-4mm的根际土壤，分别放入密封袋，带回实验室；S2：病原菌的分离和纯化：S201：对带有根部病害的金银花植株进行洗净剪切处理得到小块根系样品，对根际土壤进行稀释处理得到根际土壤10-1和10-2倍液；S202：将步骤S201中获得的小块根系样品接种到液体专用PDA培养基中，将步骤S201中获得的根际土壤10-1和10-2倍液，通过移液枪接种到同一个液体专用PDA培养基中，根际土壤10-1和10-2倍液的总用量为900ul，根际土壤10-1倍液和根际土壤10-2倍液的用量分别为450ul，将上述两种液体专用PDA培养基置于黑暗环境温度为33℃的培养箱中培养2d；S203：用移液枪分别将步骤S202中两种液体专用PDA培养基内的菌液接种到固体专用PDA培养基上，转移的菌液量为500ul，并在黑暗环境温度为28℃培养箱中培养，挑取固体专用PDA培养基边缘的菌丝接种到新的固体专用PDA培养基上，经过多次转接培养，直到获得纯种菌株；S3：病原菌DNA的提取：刮取纯化后的病原菌菌丝于2mL离心管，并加入震荡珠，用均质仪将病原菌菌丝充分打碎，利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA；S4：PCR扩增与鉴定：以植物基因组DNA为模板，利用ITS1ITS4、RpB2RRpB2F、ACT-783RACT-512F、T1Bt2b四种引物PCR扩增相应核糖体内转录间隔区，扩增产物经1％琼脂凝胶电泳检测后进行测序获得产物序列；测序结果经NCBI-BLASTn比对分析，再通过MEGA软件的邻接法进行聚类分析，构建系统发育树，鉴定真菌种属。

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