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申请/专利权人：杭州纽安津生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，包括：步骤一，通过基因测序获得生物信息，设计合成肿瘤新生抗原多肽；步骤二，将肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞，利用细胞因子诱导DC细胞成熟；步骤三，将成熟的DC细胞与初始T细胞进行多轮共孵育刺激；步骤四，利用免疫磁珠技术分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞；步骤五，扩增得到纯度高且具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞；步骤六，冻存得到肿瘤新生抗原特异性T细胞；通过本发明的方法能够大量且高效的制备出纯度高且具有高杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞，肿瘤杀伤效率接近100％；成本低，速度快，满足市场需求。

主权项：1.一种肿瘤新生抗原特异性T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，合成肿瘤新生抗原多肽；步骤二，将所述肿瘤新生抗原多肽负载到未成熟DC细胞，利用细胞因子对未成熟DC细胞进行诱导，获得负载有肿瘤新生抗原的成熟DC细胞，所述细胞因子为以下6种组合中的任意一种：（1）500UmlTNF-α、5ngmlIL-6、5ngmlIL-1β、0.5μgmlPGE-2和0.5μgmlα4-1BB×CD40L双特异性抗体；（2）500UmlTNF-α、5ngmlIL-6、5ngmlIL-1β、0.5μgmlPGE-2和0.5μgmlOX40；（3）500UmlTNF-α、5ngmlIL-6、5ngmlIL-1β、0.5μgmlPGE-2和0.5μgmlTLR-3；（4）500UmlTNF-α、5ngmlIL-6、5ngmlIL-1β、0.5μgmlPGE-2和0.5μgmlTLR-6；（5）500UmlTNF-α、5ngmlIL-6、5ngmlIL-1β、0.5μgmlPGE-2和0.5μgmlTLR-78；（6）500UmlTNF-α、5ngmlIL-6、5ngmlIL-1β、0.5μgmlPGE-2和0.5μgmlTLR-9；步骤三，分批复苏冻存的所述成熟DC细胞，将复苏的成熟DC细胞和10μgml~50μgml的肿瘤新生抗原多肽加入初始T细胞中进行3轮的共刺激培养，在最后1轮加入复苏的成熟DC细胞和肿瘤新生抗原多肽后继续培养24~72h，从而获得含有表面被标记的肿瘤新生抗原特异性T细胞的细胞悬液；在所述共刺激培养中，所述成熟DC细胞与所述初始T细胞按照成熟DC细胞：初始T细胞=1：20~60的细胞数量比例混合；步骤四，利用免疫磁珠从所述细胞悬液中分离收集肿瘤新生抗原特异性T细胞，所述免疫磁珠为CD137免疫磁珠、IFN-γ免疫磁珠、CD69免疫磁珠、TNF-α免疫磁珠、GranzymeB免疫磁珠和Perforin免疫磁珠中的至少一种；步骤五，对所述肿瘤新生抗原特异性T细胞进行扩增处理，得到具有杀伤活性的肿瘤新生抗原特异性T细胞；其中，所述步骤一具体包括以下步骤：步骤1.1，根据肿瘤组织的全外显子与转录组测序数据分析得到体细胞突变位点，预测肿瘤新生抗原短多肽序列；步骤1.2，根据短多肽序列的起始和终止位置关系及组合方式设计出若干条对应的长多肽序列；步骤1.3，对长多肽序列进行筛选；步骤1.4，根据筛选得到的长多肽序列合成长度为15~30个氨基酸的长多肽。

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