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申请/专利权人：云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司;云南云科特色植物提取实验室有限公司

摘要：本发明公开了一种可溶高活性重组III型人源胶原蛋白的制备方法，构建含有毕赤酵母的分子伴侣蛋白Hsp104、泛素样蛋白SUMO和hCOL3A1的基因克隆，利用Hsp104修正错误折叠蛋白的特性辅助hCOL3A1正确折叠，利用SUMO对蛋白的增溶作用增加hCOL3A1的溶解性。再将利用ULP1酶对SUMO蛋白的特异性识别和切割作用，获得完全人源的重组III型胶原蛋白。这一方法得到的重组III型人源胶原蛋白产品纯度高，具备空间结构，可溶性好，活性高，产品质量稳定，产物可以制作药物或者美容化妆用品。

主权项：1.一种可溶高活性重组III型人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，根据III型人源胶原蛋白hCOL3A1，Komagataellapastris毕赤酵母的分子伴侣蛋白Hsp104和SUMO蛋白的基因序列合成编码hCOL3A1、Hsp104和SUMO的基因；根据上述合成的hCOL3A1、Hsp104和SUMO的基因序列设计引物，在Hsp104或Hsp1041-535正向引物的5’端增加与pPIC9K质粒中α-factor的基因序列3’端15bp同源序列；在SUMO正向引物的5’端加上与Hsp104或Hsp1041-535基因序列的3’末端同源的15bp序列，且在SUMO反向引物的3’末端加与hCOL3A1基因序列的5’端同源的15bp；在hCOL3A1反向引物的3’端增加与pPIC9K质粒中AOX1terminator序列5’端的15bp同源序列，扩增目的基因；S2，利用ReversePCR扩增线性化载体LinearizedpPIC9K；S3，将上述3种扩增序列与线性载体LinearizedpPIC9K质粒连接，随后将连接物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，并在含有氨苄青霉素的LB培养板上筛选阳性克隆；通过序列测序确认含有正确连接序列的Hsp104-SUMO-hCOL3A1_pPIC9K质粒和Hsp1041-535-SUMO-hCOL3A1_pPIC9K；S4，将制备得到的Hsp104-SUMO-hCOL3A1_pPIC9K质粒和Hsp1041-535-SUMO-hCOL3A1_pPIC9K质粒用限制性内切酶PmeI酶切，获得基因表达盒；将上述基因表达盒电转入毕赤酵母GS115感受态细胞，并在不含有组氨酸的最小葡萄糖培养基MD平板上筛选阳性克隆；筛选出的阳性克隆进一步以G418梯度法挑选高拷贝阳性克隆，挑取对应的阳性克隆保存菌株的同时，取部分菌落在YPD培养基中培养扩增后，提取基因组并测序，测序正确的毕赤酵母即为基因工程菌；S5，用BMGY培养基于30℃，220rpm培养毕赤酵母基因工程菌16～18小时，1:5体积比接种于发酵罐中，罐中通氧，保持氧气在75％以上，培养至OD600＝200时，加入1％甲醇诱导，30℃，诱导72小时。发酵结束后，离心收集上清，采用100kDa截流膜包进行纯化，洗脱缓冲液为pH7.4的PBS，收集100kDa的样品溶液；使用ULP1酶分别酶切重组Hsp104-SUMO-hCOL3A1蛋白和重组Hsp1041-535-SUMO-hCOL3A1蛋白，获得hCOL3A1蛋白109kDa和Hsp1041-535-SUMO蛋白71.2kDa的混合物；或hCOL3A1蛋白109kDa和Hsp104-SUMO蛋白111.3kDa；S6，纯化hCOL3A1蛋白：采用100kDa截流膜包进行纯化酶切后的hCOL3A1蛋白109kDa和Hsp1041-535-SUMO蛋白71.2kDa，收集大于100kDa的蛋白，即为hCOL3A1；采用离子交换化分离hCOL3A1蛋白109kDa和Hsp104-SUMO蛋白111.3kDa，收集hCOL3A1谱峰对应的蛋白样品溶液，即为hCOL3A1；S7，采用超滤系统脱盐、浓缩，浓缩液经冷冻干燥制得基因重组人源胶原蛋白。

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