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申请/专利权人：苏州左旋星生物科技有限公司

摘要：本发明涉及一种低拷贝去内毒素质粒的制备方法及试剂盒。该制备方法主要包括：收集菌体，裂解，去除内毒素，过重力柱，杂质清洁，质粒洗脱。该试剂盒主要包括各个试剂、裂解液过滤装置、重力层析柱、以及离子交换层析填料。本发明专门针对低拷贝质粒的制备，实现OD正常、制备量高、且内毒素水平低的技术效果。

主权项：1.一种低拷贝去内毒素质粒的制备方法，其特征是，包括以下步骤：第一步、将含有目标低拷贝质粒的细菌通过培养获得细菌培养液，离心收集细菌菌体；第二步、称重得到菌体的重量，按照重量体积比菌体：菌体裂解试剂L1：菌体裂解试剂L2：菌体裂解试剂L3=1±0.1g：15ml：25ml：25ml来确定菌体裂解试剂L1、L2、L3的体积；向菌体中加入菌体裂解试剂L1并重悬；加入菌体裂解试剂L2，持续混合，直至混合液体呈淡黄色半透明状，静置；加入菌体裂解试剂L3，持续混合，直至混合样品呈淡黄色液体且有蛋花状漂浮固形物；其中，菌体裂解试剂L1是由Tris-HCl、EDTA、葡萄糖、RNaseA以及水构成的溶液；菌体裂解试剂L2是由NaOH、SDS以及水构成的溶液；菌体裂解试剂L3是由乙酸钾、乙酸以及水构成的溶液；第三步、采用裂解液过滤装置对第二步所得混合物进行过滤，得到澄清透亮的裂解液；裂解液过滤装置中设有0.45~10μm孔径的滤膜或过滤器；第四步、向第三步所得裂解液中加入内毒素去除试剂LER，且内毒素去除试剂LER：裂解液的体积比为1±0.1：50；混匀后冰浴，直至溶液澄清；其中，内毒素去除试剂LER是由TritonX-114、乙醇按体积比1±0.1：1构成的溶液；第五步、采用重力层析柱并装填离子交换层析填料得到重力柱；使用8-15倍填料体积的离子交换层析重力柱平衡试剂LEB平衡重力柱，重力自然排空；其中，离子交换层析重力柱平衡试剂LEB是由NaCl、MOPS、异丙醇、TritonX-114以及水构成的溶液，该溶液pH为7.2±0.1；第六步、将第四步所得溶液分批次全部转移至重力柱内，重力自然排空，使用8-15倍填料体积的杂质清洁试剂LWB清洁重力柱，重力自然排空；杂质清洁试剂LWB中预先加入内毒素去除试剂LER，且体积比为内毒素去除试剂LER：杂质清洁试剂LWB=1±0.1：100，混匀后冰浴以备使用；其中，杂质清洁试剂LWB是由NaCl、MOPS、异丙醇、TritonX-114以及水构成的溶液，该溶液pH为7.2±0.1；第七步、向重力柱加入1.2-2倍填料体积的质粒洗脱试剂LEN进行洗脱，收集洗脱液；其中，质粒洗脱试剂LEN是由NaCl、MOPS、异丙醇以及水构成的溶液，该溶液pH为7.2±0.1；第八步、向洗脱液中加入异丙醇，且洗脱液：异丙醇的体积比为1±0.1：0.7，混匀后离心；移除上清，加入70±1%乙醇漂洗沉淀，且洗脱液：70±1%乙醇的体积比为1：1-2，离心；第九步、移除上清，自然风干至沉淀边缘为透明状，加入预定体积的无内毒素质粒溶剂溶解，即得低拷贝去内毒素质粒溶液。

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