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申请/专利权人：白帆生物科技(上海)有限公司

摘要：本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种精准测量重组抗CD19‑CD3双特异性抗体双靶点相对结合活性的方法，本发明的特征是用酶联免疫反应的原理分析重组抗CD19‑CD3双特异性抗体的双靶点结合活性，利用链霉亲和素‑生物素系统，将抗体与包被的CD19抗原结合后，再依次加入生物素化的CD3EG与CD3ED蛋白的混合液和偶联辣根过氧化物酶（HRP）的链霉亲和素，用酶底物显色法测定不同浓度待测抗体与CD19及CD3的结合量，通过比较待测供试品和参比品的EC50值，从而测定待测供试品的相对结合活性。整个检测方法的体系规范的制定了样品的起始浓度，包被抗原，检测板以及相应的接受标准，详细的给出测试的方法参数和相对结合活性的结果，用既有线性区间又有上下平台的四参数拟合曲线囊括了可检测的区间以及结合极限上下平台，符合各国药典和抗体药物的申报要求。

主权项：1.一种精准测量重组抗CD19-CD3双特异性抗体双靶点相对结合活性的方法，其特征在于，所述测量方法至少包括如下步骤：S1:包板：将使用包被缓冲液稀释至1μgmL的CD19抗原以100μL孔加入到反应用96孔板中，用封板膜封板，轻拍96孔板至混匀后，将96孔板在2-8℃下过夜包被17±2h；S2:洗板：清洗所述反应用96孔板，用洗板液洗板4次将多余包被蛋白清洗出；S3:封闭：将封闭液以300μL孔加入到反应用96孔板中，用封板膜封板后，置于微孔板恒温振荡器中，在25℃下孵育2h后，用洗板液洗板4次；S4:样品稀释：用稀释液将样品（参比品）预稀释至初始终浓度6μgmL，每次稀释倍数≤20，并在96孔板终进行梯度稀释，稀释比例见下表；样品的稀释浓度及稀释比例 S5:样品孵育：将稀释好的样品溶液以100μL孔吹打混匀转移至反应用96孔板中，用封板膜封板后，置于微孔板恒温振荡器中，在25℃下孵育1h后，用0.05%PBST洗板液洗板4次；S6:CD3孵育：将生物素化CD3EG与CD3ED蛋白用稀释液稀释至1μgmL，再以100µL孔加入到反应用96孔板中，轻拍96孔板至混匀后，用封板膜封板，再置于微孔板恒温振荡器中，在25℃下孵育1h后，用0.05%PBST洗板液洗板4次；S7:SA-HRP孵育：用稀释液稀释SA-HRP后，再以100μL孔加入到反应用96孔板中，轻拍96孔板至混匀，用封板膜封板，再置于微孔板恒温振荡器中，在25℃下孵育1h后，用0.05%PBST洗板液洗板4次；S8:TMB显色：以100μL孔加入显色液，轻拍96孔板至混匀后，用封板膜封板，室温避光孵育30min；S9:终止：以100μL孔加入1molL终止液，终止反应；S10:读板：将终止后的孔板至于酶标仪中，打开软件，振荡10s，以650nm为参比波长，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值A450nm650nm。

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