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申请/专利权人：南京艾迪康医学检验所有限公司

摘要：本发明公开了一种甲基化检测的引物、检测方法及其应用，包括：1特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO 1的5’端标记生物素，以及特异性测序引物SEQ NO 3；2PCR扩增反应试剂、亚硫酸盐处理试剂以及焦磷酸测序相关试剂。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可用于判断待测样本的FBXO32基因启动子甲基化状态，同时检测结果可指导医生进行相关疾病的诊断、治疗及预后评估。

主权项：1.用于FBXO32基因启动子甲基化检测引物，其特征在于，包括一对特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO1的5’端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：SEQ NO 1：5’‑GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG‑3’；SEQ NO 2：5’‑AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC‑3’；SEQ NO 3：5’‑CAACCAAATCAACCTCCC‑3’。

全文数据：用于FBX032基因启动子甲基化检测的引物、检测方法及其应用技术领域[0001]本发明属生命科学和生物技术领域，是一种FBX032基因启动子甲基化检测试剂盒。背景技术[0002]DNA甲基化成为表观遗传修饰的一个重要方式，基因启动子区的CpG岛在正常状态下一般是非甲基化的，当其发生甲基化时，常导致基因转录沉寂，使一些重要基因如抑癌基因、DNA修复基因等丧失功能，从而导致正常细胞的生长分化调控失常以及DNA损伤不能被及时修复，这些机制与多种肿瘤形成密切相关。迄今己发现许多恶性肿瘤存在一个或多个肿瘤抑制基因CpG岛甲基化。这些抑癌基因CpG岛甲基化通过阻止启动子区的碱基序列与转录蛋白复合体及其他转录因子相结合，或通过甲基化CpG结合蛋白的介导间接增强转录抑制蛋白的作用，导致相应基因的mRNA表达水平降低或缺失，进而下调蛋白的表达，最终出现细胞生长分化失控，导致癌症的发生。[0003]FBX032、Skpl、Cullin1和RoclRbxlHrtl是构成泛素蛋白连接酶复合体的四个亚单位。FBX032是F-box蛋白家族的一员，后三者是泛素连接酶SCF家族的成员，对靶点底物的降解依赖泛素化。有研究称这种泛素化作用通过MKK6p38MAPK信号通路调节。F-box蛋白通过蛋白质相互作用区域与特殊的底物连接，它通过F-box区域与Skpl捆绑再与复合体相连，参与多种细胞过程例如信号转导、转录、细胞周期进程、分化、凋亡、肿瘤形成和细胞泛素化等。研究发现FBX032可通过表遗传机制使其转录受到抑制并可能与恶性肿瘤的发生及不良预后有关。有学者在晚期卵巢肿瘤中发现FBX032的甲基化频率高达29.3%，并且FBX032的高甲基化可影响患者的预后。此外研究者在贲门癌中发现FBX032的甲基化频率高达44.6%，且与ΊΉΜ*期有关。检测FBX032的甲基化为肠癌的早期诊断提供依据，同时对其治疗方案可提供参考，有助于精准医疗的开展。[0004]目前对于FBX032启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCRMSP、亚硫酸氢盐测序PCRBSP、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM、荧光定量法。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但不能做到定量检测，并且存在较高的假阳性风险;BSP法主要是通过PCR联合sanger测序技术来检测甲基化状态，但由于其操作繁琐，因此不适合大批量检测，同时挑选克隆的数目可能会影响检测结果，因此BSP只能算是半定量法;MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CpG位点的甲基化状态；荧光定量法是基于MSP开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。发明内容[0005]本发明的目的在于，提供了一种用于FBX032基因启动子甲基化检测的引物，包括一对特异性扩增引物SEQNO1和SEQNO2,其中SEQNOl的5’端标记生物素，以及测序引物SEQNO3,其碱基序列如下所示：[0006]SEQNO1:5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；[0007]SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；[0008]SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。[0009]本发明还提供了一种FBX032基因启动子甲基化检测试剂盒，包括一对特异性扩增引物SEQNO1和SEQNO2,其中SEQNOl的5’端标记生物素，以及测序引物SEQNO3,其碱基序列如下所示：[0010]SEQNO1:5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；[0011]SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；[0012]SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’；[0013]进一步的，SEQNO1:SEQNO2的使用浓度之比为0.5μΜ:0.5μΜ。[0014]具体的，FBX032基因启动子甲基化检测试剂盒包括如下试剂：[0015]1亚硫酸盐处理试剂：BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer；[0016]2PCR扩增试剂：10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5UulTaq酶、IOuM扩增引物SEQNOl、SEQNO2以及灭菌水；[0017]3单链纯化试剂：链亲和素匕618、70%¥¥乙醇、811^1111他0!1溶液、1¥811Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；[0018]4测序试剂:DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP及测序引物（SEQN03。[0019]本发明还提供了一种所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：[0020]⑴提取样本中的DNA;[0021]ii将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；[0022]iii以步骤（ii中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物（SEQNOl、SEQNO2进行两轮PCR扩增；[0023]iiii将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；[0024]iiiii依据相关软件获得样本的FBX032启动子甲基化状态。[0025]其中，步骤（ii中，所述的的亚硫酸盐处理及纯化回收方法按照EpiTect®BisulfiteQIAGEN，美国）试剂盒说明书操作，具体步骤如下：[0026]一例样本的亚硫酸盐处理反应体系为140yL:IOyLDNA、IOyLRNasefreewater、85yLBisulfiteMix、35yLDNAProtectBuffer。[0027]反应程序为：95Γ5πάη，60Γ25πάη，95Γ5πάη，60Γ85πάη，95Γ5πάη，6TC175min〇[0028]—例样本的纯化回收方法如下：向上述亚硫酸盐反应混合液中加入310yLBufferBL其中包含10ygmLcarrierRNA，振荡混勾；加入250yL无水乙醇，振荡15s，低速离心混勾；将上述混合液移至EpiTectspincolumns，全速离心lmin，弃废液；加入500yLBufferBW，全速离心lmin，弃废液；加入500yLBufferBD，室温放置15min，全速离心Imin，弃废液;加入500yLBufferBW，全速离心Imin，弃废液;全速离心Imin，弃废液;打开离心柱盖子，并置于金属浴中，56°C5min;将离心柱置于一个干净的1.5mL离心管上，向膜中央滴加20yLBufferEB，12000rpmImin，收集得到的液体进行下一步PCR或放置-20°C保存。[0029]其中，步骤iii中，所述的的PCR扩增方法如下：[0030]—例样本的第一轮PCR体系为25yL:10*PCRBuffer2.5yL、2mMdNTP2.5yL、5*QSolutionBuffer5μί、10μΜ引物SEQNOlO·5μί、10μΜSEQN020.5yL、5UyLTaq酶0.125yL、灭菌水11.875yL、模板2yL。[0031]第一轮PCR反应程序：95°C15min预变性;94°C30s，64-56°C30s每循环（_0.5°C，72°Clmin，16个循环;94°C30s，60°C30s，72°Clmin，24个循环，72°ClOmin。[0032]一例样本的第二轮PCR体系为50yL，其中模板为第一轮PCR产物2yL，其他PCR试剂组分相同，体积增加1倍；[0033]第二轮扩增条件为95°C15min预变性;94°C30s，60°C30s，72°CImin，40个循环，72°CIOmin0[0034]其中，步骤（iiii所述的具体步骤为：将得到的50yLPCR产物与3yL链亲和素bead及47yL结合缓冲液混合，室温孵育10〜15min，期间震荡2〜3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuumprepworkstation中的Vaccuumpreptool吸取bead，将带有bead的Vaccuumpreptool依次放进70%VV乙醇、DenaturationSolutiorulXWashBuffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumpreptool放入含有49yL退火缓冲液及IyL测序引物（SEQN03的96孔板中，释放bead，将该96孔板放置于80°C2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。[0035]其中，步骤（iiiii所述的结果分析，具体为：以亚硫酸盐处理后的FBX032启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMarkCpG，通过该软件分析获得样本的FBX032启动子甲基化状态。[0036]本发明还提供了一种FBX032基因启动子甲基化的检测方法，包括以下步骤：[0037]⑴提取样本中的DNA;[0038]ii将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；[0039]iii以步骤（ii中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物SEQNOl和SEQNO2进行两轮PCR扩增；[0040]iiii将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；[0041]iiiii依据相关软件获得样本的FBX032启动子甲基化状态；所述扩增引物和测序引物的序列如下所示：[0042]SEQNO1:5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；[0043]SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；[0044]SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。[0045]本发明的有益效果：[0046]本发明的主要技术路线为PCR联合焦磷酸测序，通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析样本FBX032启动子甲基化状态。本发明采用的检测方法为PCR联合焦磷酸测序技术。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶DNApolymerase、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。依据这一原理，在检测时，只需根据单个所检位点内C和T的荧光信号强度，即可确定该位点的甲基化状态，使得检测结果更加直观。因此该方法不仅可定性，也能实现定量，甚至结合相关软件可以精确的分析所检片段区域的甲基化状态。同时，焦磷酸测序仪可在30min左右内可完成96例样本的测序，因此具备了准确性高、检测通量高、检测周期短等优势。[0047]由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本发明中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，如SEQNO1、SEQNO2和SEQNO3。在另一个实施例中，测序引物3端的结合位点直接位于所检第一个位点的前一个碱基，从而进一步缩短了检测周期。同时，扩增引物的使用比例经过多次优化实验，有较高的扩增效率。此外，由于亚硫酸盐处理过程中，样本DNA会受到一定程度的降解，从而影响后期检测，本发明中图2和图3的琼脂糖凝胶电泳结果及图4的焦磷酸测序结果也证实了这一点，图2中标本1、3和5均条带较弱，导致焦磷酸测序结果背景很高（图4，而图3中条带均很亮，焦磷酸测序结果背景很低，因而本发明采用两轮PCR，提高检出率。[0048]因此，本发明的检测方法不但可同时实现对于位点甲基化的定性和定量，同时相对其它常规检测方法具备了检测出率高，检测周期短，通量高，准确度高以及低污染风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期，有利于临床医生更好的开展相关疾病的诊断及治疗。同时可指导临床医生更好的依据病患的个体差异使用烷化剂药物，实现个体化治疗。附图说明[0049]图1是FBX032基因启动子经亚硫酸盐处理后的部分序列，其中灰色标记处为3个所检的甲基化位点。[0050]图2是本发明检测组织样本1-5的第一轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图。[0051]图3是本发明检测组织样本1-5的第二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图。[0052]图4是组织样本3第一轮PCR产物焦磷酸测序结果。因PCR产物较少，焦磷酸测序背景很高。[0053]图5是组织样本2的焦磷酸测序结果。该样本所检3个位点的甲基化百分比分别为52%、8%、7%图5测序图谱中阴影部分为五个检测位点，其中3-5为用于分析的3个位点，阴影部分上方对应框内的数值即为其甲基化百分比，下同）；该样本的FBX032启动子甲基化百分比为22%。[0054]图6是组织样本4的焦磷酸测序结果。该样本的所检3个位点的甲基化百分比分别为0%、0%及12%;该样本的FBX032启动子甲基化百分比为4%。具体实施方式[0055]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。[0056]实施例1[0057]FBX032启动子甲基化检测试剂盒，包括:一对特异性扩增引物SEQNO1和SEQNO2,其中SEQNOl的5’端标记生物素，以及测序引物SEQNO3,其碱基序列如下所示：[0058]SEQNO1:5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；[0059]SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；[0060]SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’；[0061]进一步的，SEQNO1:SEQNO2的使用浓度之比为0.5μΜ:0.5μΜ。[0062]具体的，FBX032基因启动子甲基化检测试剂盒包括如下试剂：[0063]1亚硫酸盐处理试剂：BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer；[0064]2PCR扩增试剂：10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5UulTaq酶、IOuM扩增引物SEQNOl、SEQNO2以及灭菌水；[0065]3单链纯化试剂：链亲和素beads、70%VV乙醇、8mgmlNaOH溶液、IXWashBuffer、结合缓冲液、退火缓冲液；[0066]4测序试剂:DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP及测序引物（SEQN03。[0067]5阳性对照品：含有经亚硫酸盐处理后的FBX032启动子DNA;阴性对照品：不含有经亚硫酸盐处理后的FBX032启动子DNA[0068]实施例2:FBX032启动子甲基化检测试剂盒检测流程[0069]I.FBX032启动子甲基化检测试剂盒的使用方法如下步骤：[0070]1提取样本中的DNA;[0071]2将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；[0072]3以步骤2中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物SEQN01、SEQNO2进行两轮PCR扩增；[0073]⑷将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；[0074]5依据相关软件获得样本的FBX032启动子甲基化状态。[0075]2.步骤IDNA提取:可以选择业内技术人员熟知的提取试剂进行DNA抽提，[0076]也可使用生物技术公司开发的试剂盒来进行DNA抽提。[0077]3.步骤⑵亚硫酸盐处理及纯化回收方法按照EpiTec働BisulfiteQIAGEN，[0078]美国试剂盒说明书操作，具体如下：[0079]一例样本的亚硫酸盐处理反应体系为140yL:IOyLDNA、IOyLRNasefreewater、85yLBisulfiteMix、35yLDNAProtectBuffer。[0080]反应程序为：95£€51^11，601€25111111，951€5111111，601€85111111，951€5111111，601€175min〇[0081]一例样本的纯化回收方法如下：向上述亚硫酸盐反应混合液中加入310yLBufferBL其中包含10ygmLcarrierRNA，振荡混勾；加入250yL无水乙醇，振荡15s，低速离心混勾;将上述混合液移至EpiTectspincolumns，全速离心lmin，弃废液;加入500μLBufferBW，全速离心Imin，弃废液;加入500yLBufferBD，室温放置15min，全速离心Imin，弃废液;加入500yLBufferBW，全速离心Imin，弃废液;全速离心Imin，弃废液;打开离心柱盖子，并置于金属浴中，56°C5min;将离心柱置于一个干净的1.5mL离心管上，向膜中央滴加20yLBufferEB，12000rpmImin，收集得到的液体进行下一步PCR或放置-20°C保存。[0082]4.步骤⑶所述的的PCR扩增方法如下：[0083]一例样本的第一轮PCR体系为25yL:10*PCRBuffer2.5yL、2mMdNTP2.5yL、5*QSolutionBuffer5μί、10μΜ引物SEQNOlO·5μί、10μΜSEQN020.5yL、5UyLTaq酶0.125yL、灭菌水11.875yL、模板2yL。[0084]第一轮PCR反应程序：95°C15min预变性；94°C30s，64-56°C30s每循环（_0.5°C，72°Clmin，16个循环;94°C30s，60°C30s，72°Clmin，24个循环，72°ClOmin。[0085]一例样本的第二轮PCR体系为50yL，其中模板为第一轮PCR产物2yL，其他PCR试剂组分相同；[0086]第二轮扩增条件为95°C15min预变性;94°C30s，60°C30s，72°CImin，40个循环，72°CIOmin0[0087]5.步骤⑷所述的具体步骤为:将得到的50yLPCR产物与3yL链亲和素bead及47μL结合缓冲液混合，室温孵育10〜15miη，期间震荡2〜3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuumprepworkstation中的Vaccuumpreptool吸取bead，将带有bead的Vaccuumpreptool依次放进70%VV乙醇、DenaturationSolution、IXWashBuffer中清洗10s左右，再将Vaccuumpreptool放入含有49yL退火缓冲液及IyL测序引物（SEQN03的96孔板中，释放bead，将该96孔板放置于80°C2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。[0088]6.步骤⑸所述的结果分析，具体为：以亚硫酸盐处理后的FBX032启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMarkCpG，通过该软件分析获得样本的FBX032启动子甲基化状态。[0089]实施例3:外周血样本检测[0090]选择10例外周血样本，利用本发明的试剂盒进行检测。按照实施例2中的方法进行样本DNA提取、亚硫酸处理、纯化回收、PCR扩增、焦磷酸测序及结果分析，10例样本的FBX032基因启动子甲基化状态结果如表1所示：[0091]表1外周血样本检测结果[0092][0093]注:表1中各样本甲基化百分比一栏的数值，表示FBX032启动子上3个检测位点的平均甲基化百分比值，该值由软件PyroMarkCpG分析后给出。[0094]实施例4:临床样本检测[0095]取待检的临床组织样本10例，按照实施例2中的方法进行FBX032基因启动子甲基化状态分析，结果如表2所示。[0096]表2肿瘤样本检测结果[0097][0098]由实施例3和例4的结果可知，使用本发明的PCR联合焦磷酸测序的检测方法，可成功且精确检出样本FBX032基因启动子的甲基化状态。因此，本发明的检测方法可同时实现对于位点甲基化的定性和定量，同时通过优化后的引物用量比例以及两轮PCR扩增，保证了较高的PCR扩增成功率，此外，由于联合使用焦磷酸测序技术，从而使得本检测方法具备了高准确度、高通量、检测周期短以及低污染风险等优势，最终分析结果可有利于临床医生更好的开展相关疾病的诊断、治疗及预后预测。

权利要求：1.用于FBX032基因启动子甲基化检测引物，其特征在于，包括一对特异性扩增引物SEQNO1和SEQNO2,其中SEQNOl的5’端标记生物素，以及测序引物SEQNO3,其碱基序列如下所示：SEQNO1:5,-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3,；SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，SEQNOI:SEQNO2的使用浓度之比为0.5μΜ:0·5μΜ〇3.—种FBX032基因启动子甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：1亚硫酸盐处理试剂；⑵PCR扩增试剂:包括特异性扩增引物SEQNOl和SEQN02;⑶单链纯化试剂；⑷焦磷酸测序试剂:包括测序引物SEQN03;所述扩增引物和测序引物的序列如下所示：SEQNO1:5,-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3,；SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸盐处理试剂包括BisulfiteMix、RNasefreewater和DNAProtectBuffer。5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单链纯化试剂包括链亲和素beads、70%VV乙醇、8mgmlNaOH溶液、IXWashBuffer、结合缓冲液和退火缓冲液。6.权利要求3至5之一所示的FBX032基因启动子甲基化检测试剂盒的使用方法包括：i提取样本中的DNA;ii将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；iii以步骤（ii中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物SEQNOl和SEQNO2进行两轮PCR扩增；iiii将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；iiiii依据相关软件获得样本的FBX032启动子甲基化状态；所述扩增引物和测序引物的序列如下所示：SEQNO1:5,-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3,；SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤iii的所述第一轮扩增条件为:95°：15!1^11预变性；941€3〇8,64-561€3〇8每循环（-〇.5°：，72°：11^11，16个循环；941€3〇8,6〇1€30s，72°CImin，24个循环，72°CIOmin;所述的第二轮扩增条件为95°C15min预变性;94°C30s，6TC30s，72°Clmin，40个循环，72°C10min。8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤（iiiii，包括以亚硫酸盐处理后的FBX032启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMarkCpG，通过该软件分析获得样本的FBX032启动子甲基化状态。9.一种FBX032基因启动子甲基化的检测方法，包括以下步骤：i提取样本中的DNA;ii将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；iii以步骤（ii中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物SEQNOl和SEQNO2进行两轮PCR扩增；iiii将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；iiiii依据相关软件获得样本的FBX032启动子甲基化状态；所述扩增引物和测序引物的序列如下所示：SEQNO1:5,-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3,；SEQNO2:5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；SEQNO3:5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，其特征在于，步骤（iii的所述第一轮扩增条件为：95°C15min预变性;94°C30s，64-56°C30s每循环-0·5°C，72°CImin，16个循环；941€3〇8,6〇1€3〇8,72°：1111丨11，24个循环，72°：1〇111丨11;所述的第二轮扩增条件为951€15min预变性;94°C30s，60°C30s，72°Clmin，40个循环，72°ClOmin。

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