申请/专利权人：暨南大学

申请日：2015-02-09

公开（公告）日：2015-07-29

公开（公告）号：CN104805033A

主分类号：C12N1/20(2006.01)I

分类号：C12N1/20(2006.01)I;B09C1/10(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2018.06.01#授权;2015.08.26#实质审查的生效;2015.07.29#公开

摘要：本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了一株可降解多种邻苯二甲酸酯的微杆菌（Microbacteriumsp.）J-1。所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2015055。该菌能够同时高效降解多种PAEs，弥补了菌种资源库中一菌多效菌种资源的不足；而且该菌在自然界中分布广泛，适应能力强。同时本发明提供了该菌株在修复污染土壤中的应用研究，为PAEs土壤污染的生物处理提供了技术保障。

主权项：一株微杆菌（Microbacteriumsp.）菌株J‑1，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2015055。

全文数据：—株可降解多种邻苯二甲酸醋的微杆菌Microbacteriumsp.J-1技术领域[0001]本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株可同时高效降解多种邻苯二甲酸酯的新菌株，更具体地，涉及一株可降解多种邻苯二甲酸酯的微杆菌Microbacteriimisp•]-1〇背景技术[0002]众多研宄表明，邻苯二甲酸酯类化合物Phthalicacidester，PAEs具有高毒性，致畸性、致癌性和致突变性，以及生殖毒性。PAEs主要被用作塑料工业的增塑剂，目前已成为全球最普遍的污染物之一，被美国环境保护局EPA和中国环境监测总站列为优先控制污染物prioritypollutant。根据美国国家癌症研究所的研究结果，其中邻苯二甲酸二甲酯①MP，邻苯二甲酸二乙酯DEP、甲酸二正丁酯①BP、邻苯二甲酸丁苄酯BBP、邻苯二甲酸二正辛酯D0P和邻苯二甲酸二异辛酯DEHP等6种邻苯二甲酸酯被美国EPA列为优先控制污染物。由于塑料制品的大量使用，PAEs广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。由于PAEs是一类疏水性有机污染物，具有较高的辛醇-水分配系数Kow，容易吸附于沉积物和土壤颗粒物上。目前我国农业土壤中PAEs化合物的含量一般在几ugkg至几十mgkg。己有的调查数据显示，我国农业土壤中PAEs化合物有不同程度的超标，部分土壤的个别PAEs化合物超标严重，因此PAEs污染土壤的修复问题亟待解决。[0003]环境中的PAEs可通过水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途径。近年来，PAEs的细菌降解已经得到广泛的研宄，大量高效降解PAEs的菌株已经从各类环境中分离得到，包括红树林、土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等。然而，大多数已报道的降解菌均是仅对一种邻苯二甲酸酯具有高效降解能力，而既能够高效降解简单的短链PAEs又能降解复杂的支链或长链PAEs的降解菌种质资源很少被发现。同时，关于微杆菌对PAEs污染土壤的修复效果尚无报道。发明内容[0004]本发明的目的之一是针对当前多种PAEs污染修复技术的不足，提供一种可同时高效降解多种PAEs的降解菌，该菌对PAEs降解效率高，且易培养。[0005]本发明的技术方案可通过以下技术实现：[0006]一株新的可同时高效降解多种PAEs的降解菌，具体为微杆菌Microbacteriunsp.菌株J-l，该菌株于2015年1月22日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO:M2015055,分类命名为Microbacteri⑽sp.J-1。[0007]本发明从污水处理厂的活性污泥中分离出一株对多种PAEs具有高效降解能力的微杆菌，并研究其在多种PAEs污染土壤中的修复效果，结果表明该菌可有效降低土壤中的PAEs污染，是理想的土壤环境污染修复微生物，具有十分广泛的应用前景。[0008]所述微杆菌0^“〇63^6乃_咖8?.菌株1-1在1^培养基上培养七天的菌落较小，呈黄白色，湿润，凸起，有光泽，边缘整齐。扫描电镜下多为球状或近球状，直径0.4〜1M1。[0009]所述微杆菌Hicrobacteriuffisp.菌株J-1的16SrDNA基因序列如SEQIDNO:1所示。通过NCBI官方网站http:www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16SrDNA序列进彳丁比对，结果表明该菌株与Microbacteriumsp.相似性最高，同源率达99%。[0010]所述微杆菌^ficroiiacteriunsp.菌株J-1能降解多种PAEs，特别是对短链PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分别达到78.92%和71.57%，5天的降解率则达到93.42%和87.02%，7天几乎全部降解降解率彡98%。而针对长链?々£8，虽然相比短链?々£3降解速度较慢，但随着培养时间的延长，仍能达到较好的降解效果。7天DBP、DOP和DEHP的降解率分别达到95.07%、91•11%和84.61%。[0011]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0012]本发明从污水处理厂的活性污泥中首次分离出一株对多种PAEs具有高效降解能力的微杆菌，该菌株能降解多种PAEs，特别是对短链PAEs。本发明提供的降解菌弥补了菌种资源库中一菌多效菌种资源的不足;而且该菌在自然界中分布广泛，适应能力强。同时本发明提供了该菌株在修复污染土壤中的应用研宄，为PAEs土壤污染的生物处理提供了技术保障。附图说明[0013]图1为J-1菌株在LB培养基上培养7天的生长形态特征。[0014]图2为J-1菌株的扫描电镜照片。[0015]图3为J-1菌株的16SrDNA的系统发育树。[0016]图4为J-1菌株对五种混合PAEs的降解效果。[0017]图5为未接菌的污染土壤处理中各PAEs的降解效果。[001S]图6为J-1菌株对污染土壤处理中各PAEs的降解效果。具体实施方式[0019]下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。[0020]实施例中所述培养基配方如下：[0021]无机盐培养液（MSM，gL:K2HPO4:5.8，KH2P〇4:4•5，（NH42S〇4:2•0，MgCl2:0•16，CaCl2:0.02，Na2Mo〇4•2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl2•2H2O:0.0015。最终pH为7.5。[0022]牛肉膏蛋白胨培养基LB:酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，加超纯水至1L，调节pH=7_0;121°C灭菌20min。固体平板则添加1.5%wv琼脂粉。[0023]实施例1菌株的分离与鉴定[0024]采集污水处理厂的活性污泥，称取5g活性污泥样品于含有50mL无菌水的150mL三角瓶中，在30°C，140rpm培养3天后，取5mL污泥悬液加入含有100mLPAEs分别含50mgL01^、0£?、08?、00?和0£即的上述10«培养基中。经30°：，140印111培养7天后，每次按取1mL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高培养基中PAEs含量至800mgL。然后将驯化10次的培养液稀释1〇3〜1〇5涂布于LB固体平板上，30°C倒置培养1〜3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号J-1。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态见图1。由图1可知，J-1菌株在LB培养基上培养七天的菌落较小，呈黄白色，湿润，凸起，有光泽，边缘整齐。[0025]扫描电镜观察鉴定:将纯化后的J-1菌株接入含有10mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800uL菌液经8000rpm离心3〜5min，去上清液，加入500ULPBS洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入1mL2.5%戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然后再次经8000rpm离心3〜5min，去上清液，加入500uLPBS洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15min，然后8000rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20min，方法同上述乙醇脱水过程。经过C02干燥后制片观察。图2可见在扫描电镜下J-1菌体多为球状或近球状，直径0.4〜lym。[0026]菌株的16SrDNA分子鉴定:提取J-1菌株的总DNA，用细菌16SrDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海生工完成测序后，菌株的16SrDNA序列如SEQIDN0:1所示。将测序结果与GenBank中已报道的MSrDNA序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析。如图3所不，J-1菌株与MicroiiacteriufflresistensstrainNIOT-Cu-11GenBankaccession：KJ575058^PAficrobacteriumresistensstrainAGP4-3GenBankaCCesSi〇n:AY277553进化距离最短，同源性最高。其培养特征与扫描电镜观察特征与微杆菌Wicrobacteriunsp.也最为相似，因此本发明筛选获得的降解菌为微杆菌Microbacteriumsp.〇[0027]因此，发明人将微杆菌^icrobacteriunsp.菌株J-l保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏日期是2〇15年1月22日，保藏编号是CCTCCNO:M2015055;所述菌株命名为Microbacteriumsp.J-1。保藏地址为：中国武汉武汉大学。[0028]实施例2菌株J-1对多种PAEs的降解效果实验[0029]S1.囷悬液的制备:将纯化后的囷株J-1接入含有10mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000rpm离心10min收集菌体，用F*BS洗菌3次后重悬，调节〇D6G〇nm=1.0作为菌种悬液。[0030]S2.向含有200mgL浓度PAEs分别含200mgL的DMP、DEP、DBP、D0P和DEHP的100mLMSM培养液中接种上述菌悬液1mL，以不接菌作为对照，并调节PH为7.0,每组三个重复。在3〇°C，15〇rpm恒温摇床培养7天，分别于0，1，3，5，7天取样并抽提样品，经GCMS测定样品中DMP、DEP、DBP、D0P和DEHP的降解情况。[0031]S3•样品处理:将在摇瓶中培养后的样品100mL转移入分液漏斗，加入20mL二氯甲烷振荡萃取10min，用1即mL三角瓶收集有机相（下相），分液漏斗中的水相再加入20mL的二氯甲烷相同方法振荡萃取3次，合并有机相，然后过含有18cm已烘干的无水Na2S〇4玻璃柱1.5cmX35cm进行干燥，用鸡心瓶收集滤液，经旋转蒸干后定容1〇mL待测。[0032]色谱条件:采用岛津公司QP2010Plus型GCMS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦Hp一5柱子0.25MiX0_25mmX30m，进样温度为25〇°C，离子源EI温度为22TC，采用不分流进样1UL，载气为高纯氦气。升温程序为:初始温度为l〇〇°C，保持2min，l5°Cmin梯度上升至129°C，然后以40°Cmin升温至280°C，保持5min。[0033]质量控制:采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为90•5〜107•6%，相对偏差低于10•7%，仪器检测限为0.62-1.22ugmL。[0034]由附图4可知，随着培养时间的延长，五种PAEs的降解率显著上升。特别是对短链PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分别达到78•92%和71.57%，5天的降解率则达到93.42%和87.02%，7天几乎全部降解降解率彡98%。而针对长链PAEs，虽然相比短链PAEs降解速度较慢，但随着培养时间的延长，仍能达到较好的降解效果。7天DBP、DOP和DEHP的降解率分别达到95.07%、91.11%和84.61%。同时也说明，11-1菌更易于利用短链和长直链?4£3，对于带有长支链的DEHP降解效果相对较差，但7天的降解率也超过80%，说明该菌能够高效的利用各种PAEs，可以作为PAEs污染环境生物处理的理想微生物。[0035]实施例3菌株J-1对多种PAEs污染土壤的修复效果[0036]S1.供试土壤制备:土壤为华南农业大学农场水稻土，风干后过60目筛，pH为6.7，向其中添加五种PAEs包括DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP，使土壤中各PAE含量分别达到100mgkg，并加双蒸水调至田间持水量约30%，避光老化15天。[0037]S2.实验处理:分别称取上述含100mgkg_1DBP的土壤200g于三角瓶中，向土壤中添加菌悬液50mL，充分混匀，另外不接菌的处理为对照组。将土壤调至田间持水量约30%的含水量），在30°C恒温箱中避光培养，分别于0，2，4，6，8，10天定期取样抽提，然后经GCMS测定土壤中各PAEs残留量。[0038]S3•样品抽提：称取1g风干磨碎的土壤样品于35mL玻璃离心管中，加入20mL的二氯甲烷并超声萃取1〇min，然后经3500rptn离心收集上清液。土样沉淀中再加入20rnL的二氯甲烷相同方法超声萃取3次，合并上清液。然后经旋转蒸发浓缩上清液，用二氯甲烷超声清洗后过柱子（1.0cmX35cm，填料自上而下为无水NasSCk，硅胶和氧化铝），用鸡心瓶收集滤液经N2吹干后，用色谱纯二氯甲烷重新溶解并定容至1mL，待GCMS测定。[0039]GCMS色谱条件同上所述。[0040]质量控制:米用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为92.5〜110•2%，相对偏差低于10•5%，仪器检测限为〇.12-0.45ugg—1。该方法满足痕量有机物定量分析要求。[0041]如图6所示，与未接菌的污染土壤中PAEs降解效果（图5相比，Mcrobacteri⑽sp.J-1菌显著增强了土壤中各PAEs的降解效果。与纯培养结果一致，J-1菌对短链PAEs如DMP、DEP的降解效率较高，1〇天的降解率均超过了％%。对长直链的DBP和D0P的降解效果也较好，10天的降解率分别为91.51%和79.98%。对长支链的DEHP的10天降解率为69.71%。而10天的未接菌的土壤中DMP、DEP、DBP、DOP、DEHP降解率分别为21•37%，17•83%，11•84%，9.62%，6.88%。可见，Microtecteriufflsp_J-1菌能够显著提高污染土壤中PAEs的消除，在PAEs污染土壤修复中具有良好的应用潜力。

权利要求：1.一株微杆菌Microbacteriumsp.菌株J-1，所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM2015055。2.权利要求1所述的微杆菌菌株J-1在降解土壤邻苯二甲酸酯中的应用。

百度查询： 暨南大学 一株可降解多种邻苯二甲酸酯的微杆菌（Microbacterium sp．）J-1

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