申请/专利权人：北京协同创新研究院

申请日：2018-01-18

公开（公告）日：2018-07-13

公开（公告）号：CN108277175A

主分类号：C12N1/20(2006.01)I

分类号：C12N1/20(2006.01)I;B09C1/10(2006.01)I;C02F3/34(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N;C02F101/38(2006.01)N;C02F103/36(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.14#授权;2018.08.07#实质审查的生效;2018.07.13#公开

摘要：本发明公开了一株2，4‑二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株Microbacterium sp.X3及其应用。该菌株已于2017年9月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.14586。本发明还公开了筛选2,4‑二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌株的方法以及应用此菌株降解TNT红水及红水污染土壤的使用方法。将上述菌株培养至对数生长期，接种到2，4‑DNT‑3‑SA和2，4‑DNT‑5‑SA浓度分别为500mgkg的污染土壤中，经过4‑6天处理后，两种2,4‑二硝基甲苯磺酸盐的去除率均达到100％。该菌株硝基化合物类有机污染土壤修复中具有很好的应用。

主权项：1.一株2,4‑二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Microbacterium sp.X3，其特征在于，所述菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.14586，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

全文数据：2,4二硝基甲苯横酸盐高效降解菌株Microbacteriumsp.X3及其应用技术领域[0001]本发明属于环境生物领域，具体涉及一株TNT红水污染土壤中主要污染物2，4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Microbacteriumsp.X3的分离及应用背景技术[0002]TNT红水是TNT废水的一种，产生于TNT精制过程。三段硝化法制得的TNT粗品大概含有4.5%的同分异构体，主要是2,4,5—和2,3,4一三硝基甲苯。为达到军用纯度，通常采用亚硫酸钠精制法对TNT粗品进行精制，去除这些同分异构体。亚硫酸钠可与TNT的同分异构体进行反应，分别生成2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA，为TNT红水中的主要成分。TNT红水的渗漏造成了严重的土壤污染问题。[0003]土壤生物修复技术发源于20世纪80年代，与物理和化学法相比，生物修复技术具有成本相对较低、处理效果较好、操作简单、不易造成二次污染、能实施原位处理等优点，成为一种高效、经济和生态友好型的修复技术，是当前土壤修复技术研究领域的前沿，且具有实际应用价值。[0004]许多学者分离出了能应用于火炸药污染物降解的菌株。Duque等首次从TNT污染土壤中分离出能降解TNT的细菌一假单胞杆菌C1S1，该细菌能够将了阶、2,4-0阶，2-1^1'作为唯一氮源。Oh等人从TNT污染土壤中分离出绿脓杆菌属，该均属能产生硝基还原酶促进TNT的降解。Nyanhongo等人从TNT污染水体和土壤中分离出假单胞菌属GG04和芽孢杆菌SFJMI杨浦晓得降解TNTAumuscu等人分离出了无色菌STE11，能将TNT作为唯一的氮源，主要转化为DNT、AMNT。Khan等人从TNT污染场地中分离出新型嗜甲基菌属，该菌群在加入淀粉强化情况下能将TNT苯环开环且不产生其它有毒副产物。[0005]但是，尚未有研究指出在土壤中分离出可以降解二硝基甲苯磺酸盐的微生物。本发明从土壤中分离出一株可以降解二硝基甲苯磺酸盐的工程菌株并将其制成菌液，投加到TNT红水污染土壤中进行土壤修复。发明内容[0006]本发明的目的在于克服现有TNT红水及TNT红水污染土壤修复技术的缺陷和不足，提供一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐高效降解菌及其应用。[0007]为实现上述发明的目的，本发明的技术方案为：[0008]一株2,4_二硝基甲苯横酸盐高效降解菌株Microbacteriumsp.X3,于2017年9月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCCNO.14586,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。[0009]本发明所提供的高效降解菌株Microbacteriumsp.X3由从甘肃省白银TNT红水污染土壤中富集、驯化、分离纯化得到。菌落呈黄色，圆形隆起，表面光滑湿润，易挑取，革兰氏染色阴性。在显微镜下细胞呈短杆状。上述菌株的16SrRNA基因序列特征，采用分析法将序列与数据库进行比对分析，发现该菌株属于微杆菌属Microbacteriumsp.，其DNA序列表如其DNA序列表如序列表所示。[0010]上述2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Microbacteriumsp.X3或其菌悬液在降解硝基芳香族炸药TNT、DNT、MNT等方面的应用也在本发明的保护范围之内。[0011]2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌Microbacteriumsp.X3在10-40°C条件下均能很好生长，对高浓度的2，4-二硝基甲苯-3-磺酸盐和2，4-二硝基甲苯-5-磺酸盐均具有很好的耐受性，对温度、pH值得适应范围较广，可以在恶劣环境下生存，并能在较短时间内有效的降解两种二硝基甲苯磺酸盐。在TNT红水和污染土壤修复中具有很好的应用前景。[0012]上述应用的具体方法为:使用前将降解菌株Microbacteriumsp.X3在LB液体培养基中，35°C条件下活化至对数生长期，将菌液以5-10%的接种量接种于TNT红水或污染土壤中。[0013]优选的，所述的降解的最佳条件为：10%的接种量，液土比为2:5，温度为35°C，pH为9〇附图说明[0014]图1为菌株Microbacteriumsp.X3的群落形态[0015]图2为菌株Microbacteriumsp·Χ3的扫描电镜图[0016]图3为菌株Microbacteriumsp.X3在30°C下的生长曲线[0017]图4为Microbacteriumsp.X3对两种2,4_二硝基甲苯磺酸盐的降解曲线。[0018]图5为Microbacteriumsp.X3在不同pH下对两种2,4_二硝基甲苯磺酸盐的降解率。[0019]图6为Microbacteriumsp.X3在不同温度下对两种2,4_二硝基甲苯磺酸盐的降解率。具体实施方式[0020]以下实施例所用试剂如下：[0021]1含2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的无机盐固体培养基：2，4-DNT-3-SA0·5g，2,4-DNT-5-SA0.5g,NaCl30g,NH4NO33g,KH2PO4Ig1K2HPO4Ig1CaCl20.02g,MgSO40.5g,琼脂粉20g;去离子水1L;微量元素溶液10ml。高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。[0022]微量元素溶液:CuS〇40.05g，MnS〇40.05g，FeS〇4.7H200.05g，去离子水50ml。[0023]2LB液体培养基:胰蛋白胨IOg，酵母提取物5g，氯化钠IOg，蒸馏水IOOOmL。高压灭菌后备用。[0024]3LB固体培养基LB液体培养基中加入18gL琼脂，高压灭菌后取出倒置平板，凝结后备用。[0025]菌株的分离纯化：[0026]土壤样品采自甘肃省白银市（东经1044343.907〃、北炜36°3〇Μ4.676〃），装于自封袋中，于4°C保存运回实验室。[0027]富集培养：取污染土壤IOg放入装有IOOmlLB液体培养基的锥形瓶中，在30°C、120rpm的恒温要床上进行震荡，富集培养24h，[0028]驯化:取Iml上述培养液用涂布棒涂布到含有2,4-DNT-3-SA和2,4-DNT-5-SA的固体无机盐培养基中，放入恒温培养箱培养7d;[0029]分离纯化:待菌落长出后，观察菌落形态，用无菌接种环从上述固体无机盐培养基中挑选形态差距大的菌落，采用平板划线分离法接种于LB固体培养基上，置于恒温培养箱中30°C倒置培养24h，待菌落长出后挑取单菌落，并以同样的方法接种至LB固体培养基。重复上述划线分离过程，直至形成形态单一的纯化菌落。[0030]菌悬液制备:将纯化后的菌株接种到LB液体培养基中，于30°C，120rpm中培养24h，并将细胞浓度调整为109CFUmL备用。[0031]菌株鉴定：提取菌株DNA，并采用通用引物8F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）及1513R5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增，扩增体系为2.5yL正引物、2.5μL反引物、45yL双蒸水，50yLsupermix，用纯化的单菌落作DNA模板。扩增条件为96°C预变性lOmin，96°C变性lsec，58°C退火30sec，72°C延伸2min，共35个循环，72°C延伸5mina6SrRNA扩增后的细菌DNA样品5yL与6X载样缓冲液IyL混合后，采用I.O%的琼脂糖凝胶5%核酸染料进行电泳检测，所用的DNAmaker为IOObpDNALadder索莱宝）。电泳条件如下：IXTAE缓冲液，电压100V，电泳时间20min。电泳结束后利用凝胶成像系统（IsogenProximaIOPhi成像观察。将扩增产物送往美吉生物进行16SrRNA测序，将测得的16SrDNA基因序列通过Blast进行相似序列搜索，将菌株的基因序列与Genbank中的16SrDNA进行比对，利用最相似序列确定其系统发育地位。[0032]实施例1:2，4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Microbacteriumsp·X3的降解能力测定[0033]取未污染土壤，风干研磨、过Imm筛，备用。称取一定量的2,4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mgkg;在通风橱中使其自然风干2天。[0034]将一定浓度的菌悬液按照2%的接种量接种至上述土壤中。至于30°C恒温培养箱中培养，每个24h取样，采用高效液相色谱测定2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA浓度。降解曲线如附图4所示。由图可知该菌株对于浓度分别为500mgkg的两种磺酸盐具有较好的降解效果。对2，4-DNT-3-SA的降解在第6天达到100%，对2，4-DNT-5-SA的降解率较快在第4天即接近100%。[0035]实施例3:Microbacteriumsp.X3在不同pH值下对磺酸盐的降解效果[0036]取未污染土壤，风干研磨、过Imm筛，备用。称取一定量的2,4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mgkg;在通风橱中使其自然风干2天。称取上述土壤20g于锥形瓶中，用稀H2SO4和NaOH调节土壤的pH分别为3、5、7、9、11，按照5%的接种量加入0D600=1的Microbacteriumsp.X3活化的菌液，并用无机盐液体培养基调节水土比为2:5，用透气封口膜封口。将所有锥形瓶放置于30°C的恒温培养箱中静置培养一段时间并于3天后取样，测定两种磺酸盐的浓度。[0037]在不同pH条件下菌株Microbacteriumsp.X3对两种磺酸盐的降解效果如图5所示。由图5可知，本发明所述菌株pH7-11条件下条件下范围内对500mgkg的2，4-DNT-3-SA和500mgkg的2,4-DNT-5-SA均具有较好的去除效果，偏碱性条件下更有利于Microbacteriumsp.X3降解两种磺酸盐，其中pH9条件下降解效果最佳，3天内对两种磺酸盐的降解率分别为69.51%和100%。[0038]实施例4:Microbacteriumsp.X3在不同温度下对磺酸盐的降解效果[0039]取未污染土壤，风干研磨、过Imm筛，备用。称取一定量的2,4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA溶于丙酮中。在通风橱中，向上述土壤中均匀喷洒两种磺酸盐的丙酮溶液，并搅拌均匀。使土壤浓度约为2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的浓度各为500mgkg;在通风橱中使其自然风干2天。称取上述土壤20g于锥形瓶中，按照10%的接种量加入0D600=1的Microbacteriumsp.X3活化的菌液，并用无机盐液体培养基调节水土比为2:5,用透气封口膜封口。将锥形瓶分别放置于15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C的恒温培养箱中静置培养一段时间并于3天后取样，测定两种磺酸盐的浓度。[0040]在不同温度下菌株MicrobacteriumSP.X3对两种磺酸盐的降解效果如图6所示。由图6可知，本发明所述菌株使用的温度范围较广。在20-40°C范围内对500mgkg的2，4-DNT-3-SA和500mgkg的2,4-DNT-5-SA均具有较好的降解效果，降解率随着温度的先升高后降低，35°C条件下降解效果最佳，在3天内对2，4-DNT-3-SA和2，4-DNT-5-SA的降解率分别达到62.18%和98.34%。当温度较低时应适当延长修复时间。[0041]实施例5:Microbacteriumsp.X3修复实际污染土壤[0042]在以上实施例的基础上，进一步改进使Microbacteriumsp.X3能够用于修复实际TNT红水污染土壤，实验具体步骤如下：[0043]1菌株組^^^64111118?13的菌悬液制备:挑取菌株乂3的单菌落于1^液体培养基中，放置于摇床中，于35°C，120rpm条件下培养IcL采用发酵罐进行发酵培养，将上述培养的种子液按5%的接种量接种于LB培养基中，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200rmin，定时取样检测0D600值，生长至对数生长期后备用。[0044]2供试土壤:采自白银某地受TNT红水污染土壤，经自然风干，过8目筛（3mm筛）。将土样装入有机玻璃容器中，以10%的接种量开始喷洒上述X3均悬液，并用添加无机盐液体培养基至液土比为2:5。为达到最佳降解效果，可调节土壤pH为9,将容器用加热保温套包裹，维持温度在35°C。[0045]经过10天的处理后对土壤进行检测，发现对2,4-0阶-3-34、2,4-0阶-5-34的降解率为100%，在修复后的土壤中检测不到相应的污染物。

权利要求：1.一株2,4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株組〇1'^3^61'；[111118。13，其特征在于，所述菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNO.14586，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2·如权利要求1所述的一株2，4-二硝基甲苯磺酸盐降解菌株Microbacteriumsp·X3在TNT红水和TNT红水污染土壤修复中的应用。3·根据权利要求2所述应用，其特征在于，将菌株Microbacteriumsp·X3培养至对数生长期，以5%的接种量添加到污染土壤中，处理4-6天。4.如权利要求2所述的应用，所述应用具体为:挑取Microbacteriumsp·Χ3单菌落于含LB培养基的锥形瓶中，于35°C，120rpm条件下培养Id，制成种子培养液。将上述培养的种子液按5%的接种量接种于含LB培养基发酵罐进行培养，采用空气压缩机进行曝气，搅拌转速为200rmin，培养至对数生长期。，以10%的接种量喷洒上述X3菌悬液，并用添加无机盐液体培养基至液土比为2:5。为达到最佳降解效果，可调节土壤pH为9，并维持温度在35°C，1无机盐液体培养基:NaCl30g，NH4N033g，KH2P〇4lg，K2HP〇4lg，CaCl20.02g，MgS〇40.5g;去离子水1L;微量元素溶液IOml。微量元素溶液:CuS〇40.05g，MnS〇40.05g，FeS〇4.7H200.05g，去离子水50ml。2LB液体培养基:胰蛋白胨IOg，酵母提取物5g，氯化钠IOg，蒸馏水IOOOmL。高压灭菌后备用。

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