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申请/专利权人：绍兴第二医院

摘要：本发明公开了一种低频超声联合微泡造影剂诱导GBC‑SD细胞株凋亡的应用，其利用低频超声联合微泡造影剂诱导人胆囊癌GBC‑SD细胞株凋亡。本发明具有操作简便，GBC‑SD细胞增殖活性低、凋亡率高的特点。

主权项：1.低频超声联合微泡造影剂诱导GBC‑SD细胞株凋亡的应用，其特征在于：利用低频超声联合微泡造影剂诱导人胆囊癌GBC‑SD细胞株凋亡。

全文数据：低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用。背景技术[0002]GBC-SD细胞为人胆囊癌GBC-SD细胞，为原发性胆囊癌细胞。原发性胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤之一，是以发生于胆囊底部、体部、颈部及胆囊管侵犯为特征的恶性肿瘤，恶性程度极高。近年来，原发性胆囊癌患者有逐年增高的趋势，且致病因素目前尚不完全明确，其中以胆囊结石及慢性胆囊炎长期的慢性刺激更为明显。目前原发性胆囊癌缺乏有效的治疗措施。原发性胆囊癌基因突变率高和表达多药耐药基因，其对对放、化疗不敏感，总体疗效差。原发性胆囊癌己严重威胁人们的生命健康，迫切需要寻求更佳的治疗策略。加强胆囊癌分子机制的研究，提高胆囊癌的治疗效果，延长生存时间，是目前急需解决的问题。本发明针对人胆囊癌GBC-SD细胞株的活性进行试验，其直接目的不是获得人体诊断结果和健康状况，而是对脱离人体的细胞株进行处理和检测以获得中间结果。发明内容[0003]本发明提供了一种低频超声联合微泡造影剂诱导人胆囊癌GBC-SD细胞凋亡的应用，具有操作简便，GBC-SD细胞增殖活性低、凋亡率高的特点。[0004]为达到上述目的，本发明的具体方案如下：低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用，利用低频超声联合微泡造影剂诱导人胆囊癌GBC-SD细胞株凋亡。[0005]具体的，所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于包括：人胆囊癌GBC-SD细胞悬液的制备将上述人胆囊癌GBC-SD细胞和超声造影剂混合，形成混合液对上述混合液进行低频超声辐照。[0006]优选的，所述人胆囊癌GBC-SD细胞悬液的制备步骤为：用含10%胎牛血清的IMO培养液培养人胆囊癌GBC-SD细胞，在37°C、5%二氧化碳湿化培养箱中培养，每2-3天传代1次；取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，制成密度约1X106ml的细胞悬液。[0007]所述超声造影剂为六氟化硫微泡。[0008]所述低频超声为声强度为0.45mWcm2的1MHZ低频超声连续波。[0009]所述辐照时间为30s。[0010]所述超声造影剂体积占混合液体积的20%。[0011]本发明利用低频超声联合微泡造影剂诱导人胆囊癌GBC-SD细胞株凋亡，本发明具有操作简便的特点，本发明具有较高的凋亡率和较低的增殖活性。[0012]以下通过附图说明和具体实施方式对本发明做进一步阐述。附图说明[0013]图1为用CCK-8法测得的本发明和对照组的细胞平均增殖活性。[0014]图2为用流式细胞仪测得的本发明和对照组的凋亡率。[0015]标号说明：空白对照组1，单纯微泡对照组2，单纯低频超声对照组3，低频超声联合微泡组4。具体实施方式[0016]—、试剂与仪器人胆囊癌GBC-SD细胞株购于上海中科院生物研究所。[0017]超声波治疗仪购于上海市超声医学研究所，其由超声波发生器、平面换能器和单路功放组成，发射频率可设定为l-3MHz，输出功率手动可调，换能器头端为平面圆形，直径为13mm。[0018]超声造影剂为六氟化硫微泡SonoVue购于Bracco意大利公司，直径为2~5mi。[0019]胎牛血清购于Biowest公司。[0020]1640培养液购于Hyclone公司。[0021]0.25%胰蛋白酶购于美国Gibco公司。[0022]二、细胞株及培养体系：人胆囊癌GBC-SD细胞株先用含10%胎牛血清的1640培养液培养，在37°C、5%二氧化碳湿化培养箱中培养，每2-3天传代1次。实验前取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，制成密度约1X106ml的细胞悬液。将细胞悬液装入体积为1.5ml、底面积直径为13mm的聚乙烯平底圆形试管中，实验前即根据分组加入不同体积的细胞悬液和超声造影剂六氟化硫微泡S〇n〇Vue以下简称微泡），每管共1ml。[0023]三、实验分组及相应的处理方法实验中细胞共分为4组：空白对照组1:向直径13mm平底圆形聚乙烯管加入细胞悬液1ml;单纯微泡对照组2:向聚乙烯管内加入800yl细胞悬液和200yl微泡剂混匀，使微泡浓度为20%，不进行超声辐照；单纯低频超声对照组3:将充满1ml细胞悬液的聚乙烯管均匀涂上医用超声耦合剂后倒置于超声探头上，采用声强度0.45mWcm2的lfflz低频超声，不加造影剂，实验超声选取连续波，连续辐照30s;低频超声联合微泡组4:向聚乙烯管内加入800ul细胞悬液和200ul微泡，混匀后采用声强度〇.45mWcm2的1MHZ低频超声连续波辐照30s。每组设5个复孔。[0024]四、超声的辐照方法及微泡的配置室温条件下，将超声探头固定于不锈钢支架上，辐射面垂直向上，将装有细胞悬液的EP管置于超声换能器表面，EP管与换能器间涂上足量耦合剂，并排出气泡。超声辐照细胞前先将机器预热2min;使用超声造影剂SonoVueBracco,意大利公司），加5ml0.9%氯化納溶液稀释震荡摇勻。[0025]五、实验室CCK-8法测定各组细胞增殖活性将处理好的各组细胞接种到96孔板中，根据合适的铺板细胞数，每孔约10〇111细胞悬液，同样的样本做3个重复。将培养板在培养箱预培养24小时（在37°C，5%C02的条件下）。向培养板每孔加入l〇ulCCK8,加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。将培养板在培养箱孵育1-4小时后，测定45〇nm吸光度。采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600_650nm。[0026]结果:CCK-8法测定各组细胞平均增殖活性如图1所示）各组平均增殖活性为：空白对照组1为0.9272±0.1173;单纯微泡对照组2为1.0088±0.0628;单纯低频超声对照组为0.2116±0.0101;低频超声联合微泡组为0.1470±0.0029。[0027]六、流式细胞仪检测人胆囊癌GBC-SD细胞凋亡将处理好的各组细胞调整细胞密度为1X106ml，4°C离心，1000rmin，离心5min，弃上清液，将细胞重悬于200ul结合缓冲液中，加入5ulAnnexinV和5nlPI，轻轻混匀，避光室温反应15min，然后立即置入流式细胞仪进行分析。[0028]结果:流式细胞仪测各组凋亡率如图2所示）：空白对照组1的凋亡率为7.3%;单纯微泡对照组2的凋亡率为3.1%;单纯低频超声对照组3的凋亡率为25.9%;低频超声联合微泡组4的凋亡率为68.2%。[0029]可见，低频超声联合微泡组4的凋亡率大于其他各处理组。[0030]以上的具体实施方式仅为本创作的较佳实施例，并不用以限制本创作，凡在本创作的精神及原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本创作的保护范围之内。

权利要求：1.低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用，其特征在于:利用低频超声联合微泡造影剂诱导人胆囊癌GBC-SD细胞株凋亡。2.如权利要求1所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于包括：制备人胆囊癌GBC-SD单细胞悬液；将上述人胆囊癌GBC-SD细胞悬液和超声造影剂混合，形成混合液；对上述混合液进行低频超声辐照。3.如权利要求2所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于:所述人胆囊癌GBC-SD细胞悬液的制备步骤为：用含10%胎牛血清的164〇培养液培养人胆囊癌GBC-SD细胞，在37°C、5%二氧化碳湿化培养箱中培养，每2-3天传代1次；取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，制成密度约1X106ml的细胞悬液。4.如权利要求2所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于:所述超声造影剂为六氟化硫微泡。5.如权利要求2所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于:所述低频超声为声强度为〇.45mWcm2的1MHz低频超声连续波。6.如权利要求2所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于:所述辐照时间为30s。7.如权利要求2所述的低频超声联合微泡造影剂诱导GBC-SD细胞株凋亡的应用方法，其特征在于:所述超声造影剂体积占混合液体积的2〇Q。。

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