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申请/专利权人：温州医科大学

摘要：一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其利用口颊细胞作为DNA的来源，通过三种限制性核酸内切酶XBa I、Bfa I和Dde I进行特异性识别切割，然后又进行电泳以识别其突变位点，根据电泳获得的条带结果判断样本线粒体DNA G7444A突变或线粒体DNA A7445G突变以及线粒体DNA G7444A和线粒体DNA A7445G同时突变的结果，该方法经济节约，操作简单且快速有效，为耳聋的预防、分子诊断和基因治疗提供必要的技术支持，同时也为其他耳聋突变位点的针对性诊断提供了新方法新思路，具有重要科学意义和社会价值。

主权项：一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其特征在于，所述的检测方案包括以下步骤：1提取样本全基因组DNA；2特异性PCR扩增：根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对引物，通过正链引物5’‑GTAGAAGAACCCTCCATAAAC‑3’和负链引物5’‑TAGGAAGCAGATAAGGAAAAT‑3’来扩增7356位点和7696位点之间的核酸序列，最终得PCR产物；3限制性片段长度多态性聚合酶链反应：将获得的PCR产物分别通过限制性核酸内切酶XBa I、Bfa I和Dde I进行特异性识别切割，根据PCR产物分别经过限制性核酸内切酶XBa I识别TCTAGA回文结构，限制性核酸内切酶Bfa I识别CTAG回文结构，限制性核酸内切酶Dde I识别CTNAG回文结构进行内切，然后电泳以识别其突变位点，最终根据电泳获得的条带结果判断样本线粒体DNA G7444A突变和线粒体DNA A7445G突变的结果。

全文数据：一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案技术领域[0001]本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案。背景技术[0002]线粒体DNAmtDNA突变是致聋的重要诱因，与环境因素一起影响耳聋发生。线粒体tRNASeiUGN7444GA继发突变位于mtDNA环的轻链上tRNASeiUGN前体3’端核酸外切酶的作用位点（图一）附近，该突变通过更改重链上⑶I基因终止密码子序列，使COI基因编码的多肽在羧基末端增加3个氨基酸残基，从而可能对tRNA的加工修饰产生影响。与mtDNA7444GA突变位点相邻的7445AG突变可引起tRNA前体的加工缺陷，致使tRNA的稳定性和ND6mRNA的产量显著下降。在基因检测中，血液是人类DNA的良好来源，但采集血液对会损伤人的皮肤，并产生疼痛感，因此有研究者提出人类唾液中的口腔细胞可以作为另一个DNA的良好来源。目前，已有相关研究开发出了口腔细胞的提取方法及口腔细胞DNA的众多应用。[0003]目前对于突变检测最常用方法为第一代测序测序技术，但此技术对仪器要求高，操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染;PCR-限制性片段长度多态性PCR-RFLP是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐，操作过程中影响结果的不确定因素太多;近年来，变性高效液相色谱DHPLC和基因芯片的应用为点突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。发明内容[0004]为了解决现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点，本发明提供了一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，利用口腔细胞的无创检测为基础提出一种针对mtDNAG7444A突变和A7445G突变进行联合检测的新方法。[0005]本发明采用的技术解决方案是:一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，所述的检测方案包括以下步骤：[0006]1提取样本全基因组DNA;[0007]2特异性PCR扩增:根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对引物，通过正链引物5’-GTAGAAGAACCCTCCATAAAC-3’和负链引物5’-TAGGAAGCAGATAAGGAAAAT-3’来扩增7356位点和7696位点之间的核酸序列，最终得PCR产物；[0008]3限制性片段长度多态性聚合酶链反应:将获得的PCR产物分别通过限制性核酸内切酶XBaI、BfaI和DdeI进行特异性识别切割，根据PCR产物分别经过限制性核酸内切酶XBaI识别TCTAGA回文结构，限制性核酸内切酶BfaI识别CTAG回文结构，限制性核酸内切酶DdeI识别CTNAG回文结构进行内切，然后电泳以识别其突变位点，最终根据电泳获得的条带结果判断样本线粒体DNAG7444A突变和线粒体DNAA7445G突变的结果。[0009]所述的全基因组DNA从细胞、血液以及组织样本中提取。[0010]所述的提取样本全基因组DNA通过以下方法获得:使用镊子提取口腔组织样本，并转移到无菌离心管，用600yL细胞裂解缓冲液和3yL蛋白酶K混合55°C12小时，孵育后，混入600yL预冷的乙酸钾，混合物在4°C保持10分钟，然后将混合物在12000rpm下离心10分钟4°C，将上清液转移至新的2mL无菌离心管用600yL预冷异丙醇醇，混合后，将混合物离心12000印111，4°：，10分钟，倾出上清液，将沉淀物重悬浮于60^1^无水乙醇中，并在室内温度12000rpm下离心3分钟，倾出上清液后将DNA在室温下干燥，20yLddH20加入到2mL无菌离心管中以溶解DNA获得样本全基因组DNA。[0011]所述的步骤⑵特异性PCR扩增步骤如下：在IulDNA提取液，2uldNTP，0.2ul正链引物，0.2ul负链引物，2ulPRCbuffer，0.1ulTaqDNA聚合酶，1.5ul氯化镁溶液和18ul双蒸水的反应体系下，在94°C变性解链5min后，进行35次扩增循环，得到的PCR产物片段进行测序，测序结果与修正剑桥标准序列对照组对比。[0012]本发明的有益效果是：本发明提供了一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其利用口颊细胞作为DNA的来源，通过三种限制性核酸内切酶XBaI、BfaI和DdeI进行特异性识别切割，然后又进行电泳以识别其突变位点，根据电泳获得的条带结果判断样本线粒体DNAG7444A突变和线粒体DNAA7445G突变的结果，该方法经济节约，操作简单且快速有效，为耳聋的预防、分子诊断和基因治疗提供必要的技术支持，同时也为其他耳聋突变位点的针对性诊断提供了新方法新思路，具有重要科学意义和社会价值。附图说明[0013]图1为母系遗传相关的tRNASel:UGNG7444AandA7445G突变示意图。[0014]图2为PCR反应条件。[0015]图3为PCR产物的确认。[0016]图4为限制性片段长度多态性聚合酶链反应实验结果图。具体实施方式[0017]实验对象[0018]本论文将研究对象分为4组，每组选择三例样本进行检测。[0019]表一、样本表格[0020]Y:YesN:No[0021][0022]所有患者外周血样以及口颊细胞的采集均签署了温州医科大学伦理委员会审批的知情协议书。用无菌棉签在其口腔粘膜擦拭，然后将棉签风干30-60分钟并置于密封的干燥剂塑料袋中。同时，受试者自愿提供2mL外周血储存在抗凝血剂中管。到达实验室时，所有样品，包括口腔细胞样品和血液样品储存在4°C，以防止DNA的降解。[0023]提取样本全基因组DNA[0024]手工法[0025]使用灭菌的镊子将风干的口腔拭子表面上的棉花撕裂，并转移到2mL无菌离心管，用600yL细胞裂解缓冲液和3yL蛋白酶K混合55°C12小时。孵育后，混入600yL预冷的乙酸钾，混合物在4°C保持10分钟。然后将混合物在12000rpm下离心10分钟4°C。将上清液转移至新的2mL无菌离心管用600yL预冷异丙醇醇。混合后，将混合物离心12000rpm，4°C，10分钟。倾出上清液，将沉淀物重悬浮于600yL无水乙醇中，并在室内温度12000rpm下离心3分钟。倾出上清液后将DNA在室温下干燥，20yLddH20加入到2mL无菌离心管中以溶解DNA。[0026]试剂盒法[0027]使用QIAampDNAMiniKits50根据口腔拭子的规格提取口腔细胞DNA。根据血液和体液的说明书，使用HiPureTissueDNAMiniKits提取血液DNA。通过分光光度法在260nm和280nm测定总DNA浓度和纯度，通过将DNA浓度乘以DNA样品的最终体积计算DNA产量。[0028]特异性PCR扩增[0029]通过PCR扩增获得12SrRNA的DNA片段，并进行DNA测序分析。我们使用正链引物5’-GTAGAAGAACCCTCCATAAAC-3’和负链引物5’-TAGGAAGCAGATAAGGAAAAT-3’来扩增7356位点和7696位点之间的核酸序列，反应体系为：IulDNA提取液，2uldNTP，0.2ul正链引物，0.2ul负链引物，2ulPRCbuffer，0.1ulTaqDNA聚合酶，1.5ul氯化镁溶液和18ul双蒸水。首先94°C5min变性解链后，进行35次扩增循环94°C30s，51°C45s，72°C60s，最后为72°C6min的延伸过程，如图二所示。PCR产物片段送测，测序结果与修正剑桥标准序列GenBankAccessionNo.NC_001807对照组对比。产物纯化后电泳检测得到，如图三所示。[0030]限制性片段长度多态性聚合酶链反应[0031]PCR产物总长341bp，可以被限制性核酸内切酶XBaI、BfaI和DdeI特异性识别切割。我们分别按次序使用这三种酶对PCR产物进行酶切电泳以识别其突变位点。使用10%聚丙烯酰胺凝胶在100V下电泳分离Ih来分析酶消化产物，使用凝胶配比方案为2.4ml5XTBE，88ul10%过硫酸铵，4ml30%聚丙烯酰胺，8ulTEMED。电泳完成后的凝胶块用Gelred1:IOOOOinIxTBE荧光核酸凝胶染色试剂染色lOmin，然后在成像系统上观察拍摄。[0032]实验结果[0033]本发明对象分为4组，每组选择三例样本，现选取每组的第一例样本进行说明，限制性内切酶有其特定的识别序列，识别序列中的任何一个碱基的改变都将导致酶切位点的消失。第一种限制酶作用时极可能切除了第二种限制酶的作用位点，使得酶切反应无法继续进行，因此需要严格分步进行酶切操作。[0034]第一步，选择XBaI进行检测。D组对照组获得一条341bp的条带，而其他突变组则获得85bp和256bp的条带。（图4我们以此可识别无突变的DNA样本。[0035]第二步，选择BfaI进行检测。C组（携带mtDNAA7445G突变的样本）获得86bp和255bp的条带，而A组与B组则只获得一条341bp的条带。（图4通过第二步我们可识别mtDNA7445AG突变。[0036]第三步，选择DdeI进行检测。B组（携带mtDNAG7444A突变的样本）可获得一条341pb的特异条带，而A组侗时携带mtDNAG7444A突变及mtDNAA7445G突变）则获得86bp和255bp的条带。（图4[0037]诸如上述，则根据相应的条带结果即可准确判断该样本的突变情况。此外，提取所得血液DNA和口腔上皮细胞DNA的检测结果均没有显著差异。最后，我们以此方案对各个样本重新进行检测，结果均符合实际。

权利要求：1.一种线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其特征在于，所述的检测方案包括以下步骤：1提取样本全基因组DNA;2特异性PCR扩增:根据人类线粒体基因剑桥参考序列特异性设计一对引物，通过正链引物5’-GTAGAAGAACCCTCCATAAAC-3’和负链引物5’-TAGGAAGCAGATAAGGAAAAT-3’来扩增7356位点和7696位点之间的核酸序列，最终得PCR产物；3限制性片段长度多态性聚合酶链反应:将获得的PCR产物分别通过限制性核酸内切酶XBaI、BfaI和DdeI进行特异性识别切割，根据PCR产物分别经过限制性核酸内切酶XBaI识别TCTAGA回文结构，限制性核酸内切酶BfaI识别CTAG回文结构，限制性核酸内切酶DdeI识别CTNAG回文结构进行内切，然后电泳以识别其突变位点，最终根据电泳获得的条带结果判断样本线粒体DNAG7444A突变和线粒体DNAA7445G突变的结果。2.根据权利要求1所述的一种非综合征型聋相关的线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其特征在于:所述的全基因组DNA从细胞、血液以及组织样本中提取。3.根据权利要求1所述的一种非综合征型聋相关的线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其特征在于，所述的提取样本全基因组DNA通过以下方法获得:使用镊子提取口腔组织样本，并转移到无菌离心管，用600yL细胞裂解缓冲液和3yL蛋白酶K混合55°C12小时，孵育后，混入600yL预冷的乙酸钾，混合物在4°C保持10分钟，然后将混合物在12000rpm下离心10分钟4°C，将上清液转移至新的2mL无菌离心管用600yL预冷异丙醇醇，混合后，将混合物离心12000rpm，4°C，10分钟，倾出上清液，将沉淀物重悬浮于600μL无水乙醇中，并在室内温度12000rpm下离心3分钟，倾出上清液后将DNA在室温下干燥，20μLddH20加入到2mL无菌离心管中以溶解DNA获得样本全基因组DNA。4.根据权利要求1所述的种非综合征型聋相关的线粒体DNAG7444A突变及线粒体DNAA7445G突变的联合检测方案，其特征在于，所述的步骤2特异性PCR扩增步骤如下:在IulDNA提取液，2uldNTP，0.2ul正链引物，h2ul负链引物，2ulPRCbuffer，0.1ulTaqDNA聚合酶，1.5ul氯化镁溶液和18ul双蒸水的反应体系下，在94°C变性解链5min后，进行35次扩增循环，得到的PCR产物片段进行测序，测序结果与修正剑桥标准序列对照组对比。

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